金曉蓉 孫馨 林筱潔 苗青 高瑞蘭 方桂倫

人參二醇對(duì)魚藤酮、MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用

金曉蓉 孫馨 林筱潔 苗青 高瑞蘭 方桂倫

目的 觀察人參二醇對(duì)魚藤酮、MPP+誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤損傷的影響。方法以大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，以魚藤酮（0.3、1、3、10、30μmol/L）或MPP+（0.1、0.3、1、3mmol/L）誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。設(shè)陰性對(duì)照組、人參二醇對(duì)照組（10、25、50、75、100mg/L）、魚藤酮（3μmol/L，24h）或MPP+（1mmol/L，48h）組，人參二醇（10、25、50、75、100mg/L）聯(lián)合魚藤酮（3μmol/L）或MPP+（1mmol/L）組。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；PI和Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞壞死和凋亡；并以免疫組織化學(xué)測(cè)定細(xì)胞酪氨酸羥化酶（TH）的表達(dá)。結(jié)果人參二醇（10、25、50、75、100mg/L）本身不會(huì)抑制PC12細(xì)胞增殖，其中50、75mg/L人參二醇還可促進(jìn)細(xì)胞增殖；各濃度人參二醇對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷均不具有保護(hù)作用；在MPP+處理誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，50、75mg/L人參二醇可提高細(xì)胞增殖活性，但人參二醇對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死及TH的表達(dá)無影響。結(jié)論人參二醇（50、75mg/L）對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)；人參二醇對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷無明顯保護(hù)作用。

人參二醇 魚藤酮 MPP+ 大鼠 PC12細(xì)胞

【 Abstract】 ObjectiveTo evaluate the effects of panoxadiol on rat pheochromocytoma PC12 cell injury induced by rotenone or MPP+.MethodsPC12 cell injury was induced by rotenone(0.3,1,3,10,30μmol/L，24h)or MPP+ (0.1,0.3,1,3 mmol/L,48h).Panoxadiol(10,25,50,75,100 mg/L)was used to treat rotenone or MPP+induced PC12 cells.Cell proliferation was assessed by MTT method,cell necrosis and apoptosis was detected by flow cytometry with PI(propidium iodide)and Hoechst 33342 stain,respectively.The expression of tyrosine hydroxylase was measuared via immunohistostaining.ResultsPanoxadiol (10,25,50,75,100mg/L)had no affcts on proliferation of PC12 cells and had no protection effects on cell injury induced by rotenone.When PC 12 cell injury was induced by MPP+,panoxadiol(50,75 mg/L)promoted cell proliferation but had no effects on necrocytosis and apoptosis and the expression of tyrosine hydroxylase.ConclusionPanoxadiol(50、75 mg/L)might have protection effects on PC12 cell injury induced by MPP+,which may be related to facilitation of cell proliferation;however,panoxadiol has no protection effects on cell injury induced by rotenone.

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一種常見的中老年退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，病因復(fù)雜，致殘率較高。目前臨床主要是多巴胺（dopamine，DA）替代治療，該療法不能阻止DA能神經(jīng)元繼續(xù)變性和凋亡，而且不良反應(yīng)大。目前的神經(jīng)元保護(hù)劑效果不佳，因此尋找安全有效的神經(jīng)元保護(hù)劑很有必要。人參是傳統(tǒng)的“補(bǔ)氣”中藥，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)人參具有抗衰老、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫功能的作用。人參二醇（panoxadiol）是人參總皂苷中的有效成分，既往研究證實(shí)人參二醇對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用。本研究以魚藤酮、1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞損傷，制作PD神經(jīng)元病變模型[1-2]，觀察人參二醇對(duì)魚藤酮、MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響，為PD的治療開拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 高分化的PC12細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，2～3d傳代，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 人參二醇（批號(hào)：20091130）由浙江省中醫(yī)院提供；二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、魚藤酮、MPP+、胰酶、多聚賴氨酸、Propidium iodide（PI）和Hoechst 33342購自美國(guó)Sigma公司；高糖DMEM購自美國(guó)GIBCO公司，酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體購自美國(guó)CHEMICON公司。

1.3 藥物處理及分組

1.3.1 魚藤酮處理組[1]細(xì)胞接種于96孔板或24孔板，貼壁生長(zhǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，然后加入含不同濃度魚藤酮（0.3、1、3、10、30 μmol/L）的全培養(yǎng)液，對(duì)照組換用全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)分組如下：陰性對(duì)照組；魚藤酮組（3μmol/L）；魚藤酮（3μmol/L）+人參二醇（10、25、50、75、100mg/L）組；人參二醇對(duì)照組（10、25、50、75、100mg/L）。人參二醇在魚藤酮給藥前24h加藥，并在魚藤酮處理全過程持續(xù)給藥。

1.3.2 MPP+處理組[2]細(xì)胞接種于96孔板或24孔板，貼壁生長(zhǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，然后加入含不同濃度MPP+（0.1、0.3、1、3 mmol/L）的全培養(yǎng)液，對(duì)照組換用全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)分組如下：陰性對(duì)照組；MPP+組（1mmol/L）；MPP+（1mmol/L）加人參二醇（10、25、50、75、100mg/L）；人參二醇對(duì)照組（10、25、50、75、100 mg/L）。人參二醇在MPP+給藥前24h加藥，并在MPP+處理全過程持續(xù)給藥。

1.4 MTT測(cè)定細(xì)胞增殖活性[3]藥物處理完畢后，吸棄96孔板中培養(yǎng)液，每孔加入100μl MTT（0.5mg/ml），繼續(xù)孵育2h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲亞砜（DMSO），振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光值，以各處理組吸光值與陰性對(duì)照組吸光值差值的百分比，計(jì)算存活細(xì)胞百分率。

1.5 PI和Hoechst 33342染色[3]將滅菌的蓋玻片涂以多聚賴氨酸，吹干后,放入24孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞接種，待細(xì)胞長(zhǎng)滿玻片的80%～90%，作藥物處理，洗滌后加PI和Hoechst 33342（終濃度均為0.01mg/ml），避光溫浴10min，再洗2遍后，加用4%多聚甲醛固定10min，熒光顯微鏡觀察并拍照。PI熒光為紅色（620nm），Hoechst 33342熒光為藍(lán)色（480nm）。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：24孔板每孔放置一玻片，40倍光鏡下每一玻片計(jì)數(shù)3～7個(gè)獨(dú)立視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞以上，每一處理組計(jì)數(shù)3個(gè)復(fù)孔，共1 000個(gè)細(xì)胞以上。計(jì)數(shù)全部細(xì)胞數(shù)和熒光陽性細(xì)胞數(shù)，凋亡/壞死率（%）=（熒光陽性細(xì)胞數(shù)）/（全部細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定細(xì)胞TH的表達(dá)[4]將滅菌的蓋玻片涂以多聚賴氨酸，吹干后,放入24孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞接種，待細(xì)胞長(zhǎng)滿玻片的80%～90%，小心吸去培養(yǎng)液，用PBS漂洗2遍后，加入冰甲醇冰上固定5min，再用PBS漂洗3遍，加入5%正常羊血清室溫封閉2h，取出封閉液后加入抗體稀釋液1:500稀釋抗TH抗體，置于濕盒4℃反應(yīng)過夜，回收一抗后用PBS漂洗3遍，加入熒光標(biāo)記二抗（anti-mouse IgG-Cy3，anti-Rabbit IgG-FITC，以PBS稀釋為1:200），室溫下避光反應(yīng)2h，回收二抗并再用PBS漂洗3遍。稍干后用封片劑（甘油碳酸緩沖液：甘油=1∶1，加入1∶1 000 DAPI）5 μl封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：24孔板每孔放置一玻片，40倍物鏡下每一玻片計(jì)數(shù)3～7個(gè)獨(dú)立視野，計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞以上，每組計(jì)數(shù)3個(gè)復(fù)孔，共1 000個(gè)細(xì)胞以上。計(jì)數(shù)全部細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，陽性率（%）=（陽性細(xì)胞數(shù)）（/全部細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism 4 for windows（Graph Pad Software Inc,USA）統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用??表示。各組間方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett法；方差不齊時(shí)，多組間比較采用非參數(shù)單因素方差分析，兩兩比較采用Dunns法。

2 結(jié)果

2.1 人參二醇對(duì)魚藤酮處理后PC12細(xì)胞活性的影響魚藤酮處理后，PC12細(xì)胞增殖活性隨魚藤酮濃度的升高而下降（P＜0.05）。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇，采用魚藤酮3μmol/ L處理24h，PC12細(xì)胞增殖活性為（66.8±3.31）%，與對(duì)照組（100±8.27）%比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。而人參二醇不能逆轉(zhuǎn)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性下降，見表1。

2.2 人參二醇對(duì)魚藤酮處理后PC12細(xì)胞TH表達(dá)的影響 魚藤酮（3μmol/L）處理24h后，PC12細(xì)胞表達(dá)TH為（84.8±3.75）%，和陰性對(duì)照組（91.9±3.69）%比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。人參二醇對(duì)PC12細(xì)胞的TH表達(dá)無影響（P＞0.05），見表2。

2.3 人參二醇對(duì)MPP+處理后PC12細(xì)胞增殖活性的影響 MPP+處理48 h后，PC12細(xì)胞增殖活性隨MPP+濃度的升高而下降（P＜0.01），經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇，采用MPP+ 1mmol/L處理48h作為損傷條件，處理后PC12細(xì)胞增殖活性為（84.2±4.40）%，與對(duì)照組（100±3.86）%比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。人參二醇（25、50、75mg/L）單用可促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.05或0.01），其中50、75 mg/L人參二醇可逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性下降（P＜0.01），見表3。

2.4 人參二醇對(duì)MPP+處理PC12細(xì)胞凋亡和壞死的影響 常規(guī)培養(yǎng)條件下，PC12細(xì)胞凋亡率為（6.38±1.83）%，壞死率為（0.89±0.75）%；MPP+（1mmol/L）處理48h后細(xì)胞凋亡和壞死增加，但和陰性對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。50 mg/L人參二醇不能降低MPP+引起的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，見表4。

表1 人參二醇對(duì)魚藤酮處理后PC12細(xì)胞增殖活性的影響

表3 人參二醇對(duì)MPP+處理后PC12細(xì)胞增殖活性的影響

表4 人參二醇對(duì)MPP+處理后PC12細(xì)胞凋亡和壞死的影響（%）

2.5 人參二醇對(duì)MPP+處理后PC12細(xì)胞TH表達(dá)的影響 MPP+（1mmol/L）處理48h后，PC12細(xì)胞TH表達(dá)為（87.4±2.87）%，與陰性對(duì)照組（90.2±4.17）%相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。50mg/L人參二醇對(duì)PC12細(xì)胞TH表達(dá)無影響（91.2±2.30）%，對(duì)MPP+作用后的TH表達(dá)（94.1±1.67）%亦無明顯影響（均P＞0.05）。

表2 人參二醇對(duì)魚藤酮處理后PC12細(xì)胞TH表達(dá)的影響

3 討論

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）是一種神經(jīng)毒素，它可以穿越血腦屏障，在單胺氧化酶B作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘腗PP+后進(jìn)入DA能神經(jīng)末梢和胞體，選擇性破壞黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，致神經(jīng)元變性死亡，這種細(xì)胞死亡的主要方式是細(xì)胞凋亡[5]。用MPP+制備的小鼠模型是目前最好的PD動(dòng)物模型之一，已被廣泛用于PD發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究[6]。本課題前期研究也發(fā)現(xiàn)PD模型組黑質(zhì)致密帶存活神經(jīng)元數(shù)和DA能神經(jīng)元減少。給予一定劑量的人參二醇預(yù)處理后，存活神經(jīng)元數(shù)目增多且DA能神經(jīng)元脫失現(xiàn)象減少，研究結(jié)果提示：人參二醇對(duì)小鼠PD模型損傷有一定程度的保護(hù)作用，此作用與人參二醇劑量有關(guān)，人參二醇（80、120mg/kg）作用明顯。

魚藤酮是魚藤屬植物的提取物，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的殺蟲劑，可殺滅多種植物害蟲。Betarbet等[7]在2000年首次使用魚藤酮成功地誘導(dǎo)PD大鼠模型，受到了廣泛關(guān)注。作為一種細(xì)胞毒性化合物，魚藤酮主要的生化效應(yīng)是抑制細(xì)胞呼吸鏈對(duì)氧的利用，造成內(nèi)呼吸抑制。魚藤酮對(duì)線粒體復(fù)合物Ⅰ有較強(qiáng)的親和力，可選擇性阻斷鐵-硫簇與泛醌Q的作用，中止線粒體呼吸鏈的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，造成氧化應(yīng)激及ATP生成障礙，線粒體膜通透性增加，大量釋放凋亡刺激因子和凋亡誘導(dǎo)因子，激活Caspases酶系，引起細(xì)胞凋亡[8]。由于魚藤酮能產(chǎn)生與PD流行病學(xué)和病理特征更為相似的表現(xiàn)，因而可能在機(jī)制上更接近與人類PD的自然病程[9]。Lapointe等[10]報(bào)道魚藤酮的皮下給藥引起大鼠全身毒性而非特異性神經(jīng)系統(tǒng)DA神經(jīng)元褪變。DA神經(jīng)元的損傷程度在大鼠模型之間存在巨大的種源差異（從無到完全損傷）[7]，不同的大鼠種系對(duì)魚藤酮的敏感性不同。推測(cè)可能是由于不同種系的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞種類及含量不同，星形膠質(zhì)細(xì)胞含量多而小膠質(zhì)細(xì)胞含量少的大鼠對(duì)神經(jīng)毒性藥物則有更大的耐受性[11]。

人參是傳統(tǒng)的“補(bǔ)氣”中藥，具有“補(bǔ)氣生血”作用，對(duì)人參的現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)人參具有抗衰老，抗腫瘤，提高機(jī)體免疫功能的作用。前期研究已證實(shí)，人參二醇促進(jìn)紅、粒和巨核系的造血祖細(xì)胞增殖的作用明顯，且對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示：人參二醇對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與一定濃度下促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān),而對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷無保護(hù)作用，對(duì)魚藤酮處理后PC12細(xì)胞TH的表達(dá)無影響。本課題組將進(jìn)一步深入研究，為人參二醇的的神經(jīng)保護(hù)治療機(jī)制提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Siddiqui M A,Kashyap M P,Khanna V K,et al.Association of dopamine DA-D2 receptor in rotenone-induced cytotoxicity in PC12 cells[J].Toxicol Ind Health,2010,26(8):533-542.

[2] Cartelli D,Ronchi C,Maggioni M G,et al.Microtubule dysfunction precedes transport impairment and mitochondria damage in MPP+-induced neurodegeneration[J].J Neurochem,2010,115 (1):247-258.

[3] Huang X J,Zhang W P,Li C T,et al.Activation of CysLT receptors induces astrocyte proliferation and death after oxygen-glucose deprivation[J].Glia,2008,56(1):27-37.

[4] Feng L,Meng H,Wu F,et al.Olfactory ensheathing cells conditioned medium prevented apoptosis induced by 6-OHDA in PC12 cells through modulation of intrinsic apoptotic pathways[J]. Int J Dev Neurosci,2008,26(3-4):323-329.

[5] Tatton N A,Kish S J.In situ detection of apoptontic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4phenyl-1,2,3,6-trrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidy transferase labelling and acridine orange staining[J].Neuroscience,1997,77(4):1037-1048.

[6] Chen S D,Xu D L,Yu H Z,et al.Study on 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydro-pyridine induced Parkinson's disease animal model[J].Chin Med J,1990,70(5):252-254.

[7] Betarbet R,Sherer T B,Mackenzie G,et al.Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkin's disease[J]. Nat Neurosci,2000,3(12):1301-1306.

[8] Richardson J R,Quan Y,Sherer T B,et al.Paraquat neurotoxicity is distinct from that of MPTP and rotenone[J].Toxicol Sci,2005,88 (1):193-201.

[9] Greennamyre J T,Betarbet R,Sherer T B.The rotenone model of Parkinson's disease:genes.Environment and mitochondria[J]. Parkinsonism Related Dis,2003,9(Suppl 2):s59-s64.

[10] Lapointe N,St-Hilaire M,Martinoli M G,et al.Rotenone induces non-specific central nervous system and system and systemic toxicity[J].FASEB J,2004,18(6):1096-1118.

[11] Smeyne M,Jiao Y,Sheperd K R,et al.Glia cell number modulates sensitivity to MPTP in mice[J].Glia,2005,52(2):144-152.

Effects of panoxadiol on PC12 cell injury induced by rotenone or MPP+

PanoxadiolRotenone MPP+ RatPC12 cell

2013-03-20）

（本文編輯：胥昀）

浙江省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技研究項(xiàng)目基金資助（2008CA115）

322000 義烏市中心醫(yī)院內(nèi)科（金曉蓉、方桂倫）；浙江省中醫(yī)院血液病研究所（孫馨、林筱潔、苗青、高瑞蘭）