杜權(quán) 俞文華 董曉巧

OPN和CD44v6在腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義

杜權(quán) 俞文華 董曉巧

目的檢測OPN、CD44v6在腦膠質(zhì)瘤中的表達水平，探討兩者與腦膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系以及意義。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測60例膠質(zhì)瘤和60例減壓手術(shù)中切除的正常腦組織中OPN和CD44v6的表達水平，并對兩者的表達水平與腦膠質(zhì)瘤臨床特征進行分析。結(jié)果OPN、CD44v6表達陽性率在腦膠質(zhì)瘤中分別為75.0%、66.7%，在正常腦組織中分別為16.7%、13.3%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。腦膠質(zhì)瘤中OPN、CD44v6的表達水平均與患者的年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)（均P＞0.05），但在復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)者、高級別膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）與低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ～Ⅱ級）之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而且兩者表達水平呈顯著正相關(guān)（r=0.65，P＜0.01）。結(jié)論OPN和CD44v6在腦膠質(zhì)瘤中高表達，兩者均反映了腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，并與患者預(yù)后有關(guān)，且OPN和CD44v6的表達之間有內(nèi)在聯(lián)系。

OPN CD44v6 膠質(zhì)瘤

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of osteopontin(OPN)and CD44v6 in human gliomas and their clinical significance.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expressions of OPN and CD44v6 in 60 specimens of brain gliomas and 60 specimens of normal brain tissues.The relationships between OPN and CD44v6 expressions and their correlation with clinical characteristics were analyzed.ResultsThe positive expression rates of OPN and CD44v6 in brain gliomas were 75%and 67.7%,respectively,while those in normal brain tissue were 16.7%and 13.3%,respectively (P＜0.05). There are significant differences in expressions of OPN and CD44v6 between gliomas grade III-IV and grade I-II,and between tumor with recurrence and without recurrence;however their expressions were not related to age,sex and tumor locations of patients(P＞0.05).The expression of OPN is positively correlated with CD44v6(r=0.65,P＜0.01).ConclusionThe expressions of osteopontin and CD44v6 are closely related to the malignant behaviors of glioma,and their expressions are correlated with each other.

骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）是一種分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，其中含有特異的與細胞黏附有關(guān)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列，可通過結(jié)合其受體介導(dǎo)腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲浸潤[1]；CD44 v6在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程中同樣發(fā)揮著重要作用[2]。本研究對腦膠質(zhì)瘤中OPN和CD44v6的表達進行了檢測，探討其與患者臨床特征之間的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 研究對象 收集本院2002-06—2004-12手術(shù)治療的60例膠質(zhì)瘤患者的臨床資料，其中男36例，女24例，年齡5～79歲，中位年齡47歲。術(shù)中切除的腫瘤標(biāo)本立即放入凍存管置于液氮中貯存?zhèn)錂z，病理檢查結(jié)果按2000年WHO關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類及分級標(biāo)準(zhǔn)進行分級，Ⅰ級6例，Ⅱ級21例，Ⅲ級23例，Ⅳ級10例，并對每例患者術(shù)后進行隨訪，記錄生存時間。隨訪時間6～36個月，平均（14.4±4.1）個月；其中術(shù)后復(fù)發(fā)46例，死亡35例。另以同期因顱腦外傷和高血壓腦出血患者手術(shù)減壓所得的非腫瘤正常腦組織作為對照，患者共60例，其中男40例，女20例，年齡15～79歲，中位年齡51歲。

1.2 試劑和檢測方法 采用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（S-P）法?？筄PN鼠抗人單抗購于美國Santa Cruz生物科技公司，抗CD44v6鼠抗人單抗購于北京中山生物科技公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自北京中山生物科技公司。OPN和CD44v6工作濃度分別為1∶200和1∶50，每批染色均用已知陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 采用雙盲法觀察陽性反應(yīng)，并由兩位醫(yī)師獨立觀察每張切片后一起做出判斷。用低倍鏡和高倍鏡觀察切片，判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)以下兩個方面：（1）按切片中顯色腫瘤細胞數(shù)比例計分，0分為無腫瘤細胞顯色，1分為顯色腫瘤細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)＜25%，2分為顯色細胞超過切片中腫瘤細胞總數(shù)的25%～50%，3分為顯色細胞超過切片中細胞總數(shù)的50%。（2）按切片中腫瘤細胞顯色強度計分，0分為細胞無顯色，1分為呈淺黃色（弱染色），2分為呈棕黃色（中等染色），3分為呈棕褐色（強染色）。（1）十（2）＞3分記為陽性（其中＞4分為強陽性），≤3分記為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，其中OPN和CD44v6的表達水平與臨床特征的關(guān)系分析采用χ2檢驗，OPN和CD44v6的表達水平的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 OPN和CD44v6在膠質(zhì)瘤中的表達 OPN表達大多定位于細胞胞質(zhì)，少量細胞胞膜同時陽性；CD44v6表達主要定位于細胞膜，部分細胞胞質(zhì)陽性（圖1-4，見插頁）OPN、CD44v6在腦膠質(zhì)瘤中表達陽性率分別為75.0%（45/60）、66.7%（40/60），正常腦組織的陽性率分別為16.7%（10/60）、13.3%（8/60），兩者在腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織中表達陽性率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.48、4.85，均P＜0.05)。

2.2 OPN和CD44v6表達與膠質(zhì)瘤患者臨床特征關(guān)系膠質(zhì)瘤中OPN、CD44v6的表達均與患者的年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)，但與是否復(fù)發(fā)、高級別（Ⅲ～Ⅳ級）還是低級別(Ⅰ～Ⅱ級）有關(guān)，詳見表1。

2.3 OPN和CD44v6在膠質(zhì)瘤組織中表達的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤中OPN與CD44v6的表達呈顯著正相關(guān)（r=0.65，P＜0.01），OPN和CD44v6共同表達對預(yù)測膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)更有意義，詳見表2。

表1 膠質(zhì)瘤中OPN和CD44v6表達與腫瘤患者臨床特征的關(guān)系（例）

表2 膠質(zhì)瘤中OPN和CD44v6表達的相關(guān)性（例）

3 討論

OPN是一種具有多種生物學(xué)活性的分泌型磷酸化糖蛋白，富含RGD序列，可與其αvβ3整合素、CD44等受體相互作用，促進細胞趨化、黏附、遷移和增殖，在惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展中起重要作用并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)[1,3]。Saitoh等[4]用Northern blot、Southern blot、免疫熒光細胞化學(xué)及Western blot對5株腦膠質(zhì)瘤細胞株進行OPN檢測，發(fā)現(xiàn)這些細胞株中惡性度高的OPN表達水平較高，而良性星形細胞瘤與非腫瘤組織表達水平較低，免疫組化檢測也有類似結(jié)果，Takano等[5]比較了68例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本與正常腦組織中與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、組織因子（TF）、OPN、αvβ3受體表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN和整合素αvβ3受體在多形性膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達水平明顯增高，且與VEGF、TF表達水平相關(guān)，推測OPN可能參與了腫瘤的血管形成，Jang等[6]也有類似報道。本文膠質(zhì)瘤OPN陽性表達率為75%，顯著高于正常腦組織的16.7%。此外,病理分級高的膠質(zhì)瘤OPN表達水平明顯高于病理分級低的膠質(zhì)瘤，復(fù)發(fā)者顯著高于非復(fù)發(fā)者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。我們曾通過RT-PCR半定量法檢測膠質(zhì)瘤組織OPN mRNA表達水平[7]，并探討其與腫瘤臨床特征之間的關(guān)系，也提OPNmRNA表達水平增高的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良。

目前研究認為，OPN在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的可能作用機制主要有以下幾個方面：（1）富含的RGD序列與細胞黏附密切相關(guān)，可與腫瘤細胞表面的整合素受體相結(jié)合，激活一系列細胞內(nèi)信號，促進了腫瘤細胞增殖及浸潤轉(zhuǎn)移；（2）VEGF、血管通透性因子（VPF）協(xié)同作用，促進腫瘤生長，加快腫瘤遷移；（3）以自分泌形式促進自身生長，并與自身細胞表面受體結(jié)合，導(dǎo)致細胞移動能力增強、蛋白溶解酶分泌增加，引起基質(zhì)降解；（4）抑制激活的巨噬細胞產(chǎn)生NO，提高腫瘤細胞的存活能力。可以認為：OPN表達反映了膠質(zhì)瘤不良生物學(xué)行為的特性，一方面通過信號異常傳導(dǎo)等刺激使正常細胞向惡性生物學(xué)行為細胞轉(zhuǎn)化，另一方面通過降解細胞外基質(zhì)促使腫瘤細胞浸潤遷移,致使腫瘤生長迅速,病程進展，術(shù)中難以達到生物學(xué)全切除，因此OPN有促進膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

CD44是細胞表面的跨膜糖蛋白，是介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)間相互作用的黏附分子，其功能是促進細胞外基質(zhì)與透明質(zhì)酸結(jié)合，維持組織或器官的結(jié)構(gòu)，促進細胞的浸潤和遷移[2]。本研究發(fā)現(xiàn)與OPN類似，膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)者CD44v6表達水平明顯高于非復(fù)發(fā)者、高級別膠質(zhì)瘤顯著高于低級別膠質(zhì)瘤，而與患者的年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)；相關(guān)性分析表明，OPN和CD44v6在膠質(zhì)瘤中的表達水平有顯著相關(guān)性，兩者在腫瘤細胞生物學(xué)行為轉(zhuǎn)變及侵襲轉(zhuǎn)移中可能起協(xié)同作用。我們推測其機制是腫瘤細胞高表達的OPN與其CD44v6受體相互結(jié)合，激活某種信號傳導(dǎo)途徑，引起腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化及浸潤遷移，且兩者表達有協(xié)同作用，但其確切機制尚待進一步研究。檢測OPN或CD44v6的表達水平可能有助于判斷膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為，尤其是聯(lián)合檢測對預(yù)測患者預(yù)后更具有臨床意義。

[1] Wai P Y,Kuo P C.The role of osteopontin in tumor metastasis[J]. J of Surg Res,2004,121(2):228-241.

[2] 郝波,張國新,施瑞華.食管鱗癌中骨橋蛋白和CD44 v6的表達及其意義[J].中華內(nèi)科雜志,2005,44（12）:928-929.

[3] Coppola D,Szabo M,Boulware D,et al.Correlation of osteopontin protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologies[J].Clin Cancer Res,2004,10(1):184-190.

[4] Saitoh Y,Kuratsu J I,Takeshima H,et al.Expression of osteopontin in human glioma.Its correlation with the malignancy[J]. Lab Invest,1995,72(1):55-63.

[5] Takano S,Tsuboi K,Tomono Y,et al.Tissue factor,osteopontin, alphavbeta3 integrin expression in microvasculature of gliomas associated with vascular endothelial growth factor expression[J]. Br J Cancer,2000,82(12):1967-1973.

[6] Jang T,Savarese T,Low H P,et al.Osteopontin expression in intratumoral astrocytes marks tumor progression in gliomas induced by prenatal exposure to N-ethyl-N-nitrosourea[J].Am J Pathol,2006,168(5):1676-1685.

[7] 俞文華,車志豪,許培源,等.膠質(zhì)瘤中骨橋蛋白表達的初步研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2006,35(8):17-19.

Expressions of osteopontin and CD44v6 in glioma and their clinical significance

Osteopontin CD44v6 Glioma

2012-07-26）

（本文編輯：沈叔洪）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科

俞文華，E-mail：ywh699@hotmail.com