陳岳華 陶師 朱衛(wèi)國 王云貴 錢文斌

初診急性髓系白血病患者FLT3-ITD和NPM1基因聯(lián)合突變與臨床特征的關(guān)系

陳岳華 陶師 朱衛(wèi)國 王云貴 錢文斌

目的探討初發(fā)急性髓系白血?。ˋML）患者中FMS樣酪氨酸激酶3-基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（FLT3-ITD）和核仁磷酸蛋白1（NPM1）基因突變的發(fā)生頻率，并進(jìn)一步分析其與患者臨床特征的關(guān)系。方法收集44例臨床初診為AML的成人患者骨髓標(biāo)本，通過基因組DNA-PCR技術(shù)對(duì)FLT3-ITD和NPM1基因突變進(jìn)行檢測。結(jié)果44例患者共檢測到FLT3-ITD突變10例，檢出率22.7%。FLT3-ITD突變陽性的10例患者和無突變者初診WBC中位數(shù)分別為（98.5±22.5）×109/L和（42.9±12.4）×109/L，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。44例患者共檢測到NPM1突變14例，檢出率31.8%。大部分突變患者，染色體核型正常。結(jié)論FLT3-ITD和NPM1基因突變是AML患者中常見的分子生物學(xué)異常，對(duì)患者的臨床和預(yù)后有影響。

白血病 FLT3-ITD NPM1 基因突變

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）是一組具有高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，具有復(fù)雜的染色體異常和基因突變，而FMS樣酪氨酸激酶3-基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（Fms-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication,FLT3-ITD）與核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）基因突變是其中常見的兩種。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)LT3-ITD見于25%的AML患者，可伴發(fā)于t(15; 17)與t（6；9）染色體異常，也可見于正常核型患者，為預(yù)后不良的獨(dú)立因素[1]。NPM1基因突變可見于約50%正常核型AML患者[2]，預(yù)示著患者的高緩解率與低復(fù)發(fā)率[3-4]。NPM1基因突變經(jīng)常與FLT3-ITD突變并發(fā)于正常核型AML，一些研究表明FLT3-ITD和NPM1基因突變之間存在相互影響，并影響AML疾病臨床特征。本研究探討了AML患者FLT3-ITD或/和NPM1基因突變與臨床特征的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2010-11—2011-10于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和紹興第二醫(yī)院血液科住院的初診AML患者44例，其中男27例，女17例；年齡17～74歲，平均46.5歲。FAB分型如下：M04例、M13例、M216例、M34例、M44例、M511例、M61例、雜合型1例。上述患者均接受骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)檢測。白血病分子生物學(xué)檢測包括FLT3-ITD和NPM1基因突變、AML1-ETO、PML-RARα和CBFβ-MYH11。細(xì)胞遺傳學(xué)檢測采用常規(guī)R顯帶技術(shù)，并按照“人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN1995）”進(jìn)行核型描述，其中正常染色體核型的患者37例。所有患者均符合AML診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。M3患者接受維甲酸聯(lián)合三氧化二砷為主的誘導(dǎo)緩解方案，其余患者接受蒽環(huán)類化療藥物聯(lián)合阿糖胞苷為主的誘導(dǎo)緩解方案。

1.2 PCR檢測 分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，利用美國Invitrogen公司DNA抽提試劑盒提取DNA。FLT3-ITD引物：正義鏈：5′-GCAA TTTA GGTA TGAA AG-3′；反義鏈：5′-CTTT CAGC ATTT TGAG GGCA ACC-3′。NPM1基因第12外顯子引物：正義鏈：5′-TTAACTCT CTGG TGGT AGAA TGAA-3′；反義鏈：5′-TGTT ACAG AAAT GAAA TAAG ACGG-3′。上述引物均由上海Sangon公司合成。反應(yīng)體系總體積20μl，包括200ng DNA、20pmol PCR引物、25mmol/L MgCl2、2.5mmol/L dNTP、2μl 10×PCR緩沖液、0.2μl Qiagen HotTaq DNA多聚酶和水。反應(yīng)條件：變性95℃15min，95℃20s，60℃40s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)后72℃30min。PCR產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則以中位數(shù)和范圍表示，組間比較使用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 AML患者FLT3-ITD突變的特征 44例患者共檢測到FLT3-ITD突變10例，檢出率22.7%。其中正常染色體核型的患者中檢出率21.6%（8/37）。1例FLT3-ITD突變陽性的AML患者并存t（15;17），另1例則并存t（8; 21）。突變陽性的10例患者中包括M12例、M24例、M32例、M51例、M61例。

FLT3-ITD突變陽性的患者和突變陰性患者初診血WBC分別為（98.5±22.5）×109/L和（42.9±12.4）×109/L，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。而性別、發(fā)病年齡方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。治療效果方面，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性的10例患者中8例完全緩解，與突變陰性患者比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 AML患者NPM1突變的特征 44例患者共檢測到NPM1突變14例，檢出率31.8%。其中正常染色體核型的患者中檢出率32.4%（12/37）。1例NPM1突變陽性的AML患者并存inv（16），另1例則并存t（8;21）。突變陽性的14例患者中包括M01例、M13例、M25例、M42例、M53例。

2.3 FLT3-ITD與NPM1基因突變與臨床特征的關(guān)系 將44例患者分為FLT3-ITD-/NPM1-，F(xiàn)LT3-ITD+/NPM1-，F(xiàn)LT3-ITD-/NPM1+與FLT3-ITD+/NPM1+4組。其中，兩者均陰性的24例（54.5%），F(xiàn)LT3-ITD+/NPM1-共6例（13.6%），F(xiàn)LT3-ITD-/NPM1+共10例（22.7%），兩者均陽性共4例（9.1%）。兩種突變與患者臨床特征的關(guān)系見表1。

表1 FLT3-ITD與NPM1突變與臨床特征的關(guān)系

2.4 FLT3-ITD與NPM1突變與染色體核型的關(guān)系 44例患者中染色體核型正常者37例，核型異常者7例，其中3例患者FLT3-ITD與NPM1突變均為陰性。FLT3-ITD突變與NPM1突變者均有2例患者合并核型異常。

3 討論

AML作為一組具有高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其臨床特征、療效及預(yù)后均有重大差異。以染色體異常為基礎(chǔ)的細(xì)胞遺傳學(xué)分層，對(duì)于AML的治療起了重要的指導(dǎo)作用。然而受檢測技術(shù)限制，約40%AML患者提示正常染色體核型[6]，此類患者被歸類為中危預(yù)后，這種歸類缺乏精確性。隨著分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，大多數(shù)AML患者可以檢測出基因水平的異常，并促進(jìn)了分子遺傳學(xué)預(yù)后分層的產(chǎn)生。其中，F(xiàn)LT3和NPM1基因的突變?yōu)楣J(rèn)的兩大重要檢測指標(biāo)。

本研究中，F(xiàn)LT3-ITD突變檢出率22.7%，與國際上大宗研究報(bào)道相似，提示采取基因組DNA-PCR及PAGE電泳可以作為有效的FLT3-ITD檢測技術(shù)。而在正常染色體核型的37例患者中，F(xiàn)LT3-ITD突變檢出率為21.6%，略低于現(xiàn)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。NPM1突變檢出率31.8%，較現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道偏低，考慮為樣本量偏小所致，在進(jìn)一步研究中將繼續(xù)積累數(shù)據(jù)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在3例AML-M1患者中均檢測出NPM1基因突變，檢出率100%，與吳德沛等[7]研究結(jié)果相符。AML-M1患者中NPM1突變的高檢出率，有待進(jìn)一步積累樣本后作深入研究。

FLT3-ITD突變經(jīng)常伴隨NPM1突變同時(shí)發(fā)生，有報(bào)道稱達(dá)到正常核型AML的43.8%，提示兩者在AML起病過程中存在一定聯(lián)系。本研究中核型正常者FLT3-ITD和NPM1突變檢出率分別為21.6%和32.4%，而核型異常者的檢出率均為28.6%。與文獻(xiàn)報(bào)道有差異[2]，可能與AML亞型分布不同有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NPM1突變往往促使白血病細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性下降，這可能是其經(jīng)常伴隨FLT3-ITD突變發(fā)生的原因[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3-ITD+/NPM1+組AML患者初診時(shí)血白細(xì)胞數(shù)顯著增高，4例患者中3例超過100×109/L，符合這兩種基因突變給細(xì)胞帶來強(qiáng)烈增殖活性的理論。

本研究將進(jìn)一步收集并隨訪初診AML患者，更精確分析FLT3-ITD突變和NPM1突變與患者臨床特征的關(guān)系，進(jìn)一步了解其對(duì)AML療效和預(yù)后的判斷作用。

[1] Bullinger L,Valk Y J.Gene expression profiling in acute myeloid leukemia[J].J Clin Oncol,2005,23(26):6296-6305.

[2] Falini B,Mecucci C,Tiacci E,et al.Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].N Engl J Med,2005,352(3):254-266.

[3] Mrozek K,Marcucci G,Paschka P,et al.Clinical relevance of mutations and gene-expression changes in adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics:are we ready for a prognostically prioritazed molecular classification[J]?Blood,2007,109(2): 431-448.

[4] Gale R E,Green C,Allen C,et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level,number,size,and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia[J].Blood,2008,111(5):2776-2784.

[5] 張之南,沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版,北京:科學(xué)出版社, 2007:103-121.

[6] Karp J E.Acute myelogenous leukemia[M].New Jersey:Humana Press,2007:177-192.

[7] 吳德沛,顏靈芝,楊莉,等.急性髓細(xì)胞白血病患者NPM1與FLT3基因突變的研究[J].中華內(nèi)科雜志,2007,46(11):907-910.

[8] Bacher U,Badbaran A,Fehse B,et al.Quantitative monitoring of NPM1 mutations provides a valid minimal residual disease parameter following allogenetic stem cell transplantation[J].Exp Hematol,2009,37(1):135-142.

Correlation of FLT3/ITD and NPM1 mutations with clinical characteristics in patients with acute myeloid leukemia

ObjectiveTo investigate the frequency of Fms-like tyrosine kinase 3 tandem duplication(FLT3-ITD)and nucleophosmin 1(NPM1)gene mutations in patients with incipient acute myeloid leukemia (AML),and its relationship with clinical features of patients.MethodsBone marrow samples were collected from 44 AML cases,the FLT3-ITD and NPM1 gene mutations were examined by genomic DNA PCR,and the relationship between gene mutations and clinical features was analyzed.ResultsFLT3-ITD gene mutations were detected in 10 cases with a detection rate of 22.7%.The median WBC count in AML patients with FLT3-ITD mutation was(98.5±22.5)×109/L,and that in those with no FLT3-ITD mutation was(42.9±12.4)×109/L(P＜0.05).NPM1 gene mutations were detected in 14 cases with a detection rate of 31.8%.Most patients with mutations had normal karyotype.ConclusionFLT3-ITD and NPM1 gene mutations are frequent abnormalities in acute myeloid leukemia,which may affect the prognosis of patients.

Leukemia FLT3-ITD NPM1 Gene mutation

2012-12-03）

（本文編輯：胥昀）

312000 紹興第二醫(yī)院血液科（陳岳華、陶師、朱衛(wèi)國）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科（王云貴、錢文斌）