林 雪，周 斌，甘慶雷

更年期高血壓屬于特殊人群的高血壓，以臨床癥狀多、血壓升高且血壓變異性(blood pressure variability,BPV)大為主要特點[1]，BPV增大與靶器官損傷的發(fā)生相關(guān)，降低BPV可減少對靶器官的損害。為此，本研究采用摘除自發(fā)性高血壓大鼠(SHR大鼠)卵巢的方法建立更年期高血壓大鼠復(fù)合實驗動物模型，用虛燥更平散對更年期高血壓大鼠進行干預(yù)，觀察大鼠血壓、BPV及血清兒茶酚胺(catecholamine,CA)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、神經(jīng)降壓素(neurotensin,NT)、雌二醇(estradiol,E2)、促卵泡生成激素(follicle stimulating hormone,FSH)、促黃體生成激素(luteinizing hormone,LH)的水平變化，探討虛燥更平散對更年期高血壓大鼠血壓、BPV的影響及其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物選取由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供的近交系SPF級SHR雌性大鼠55只，WKY雌性大鼠10只，周齡11周，每只體質(zhì)量(230±20)g。大鼠置于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物科學(xué)研究部實驗動物房，分籠飼養(yǎng)(干籠)，每籠3只?？刂剖覝?21±2)℃，濕度30%～70%，通風(fēng)1～2次/d、2 h/次，光照12 h/24 h，避免噪聲及其他因素干擾。大鼠喂養(yǎng)通用飼料，飲用自來水，不限制進食量、飲水量。

1.2藥物與制劑虛燥更平散(6 g/袋，批號ZJ20100010)，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；纈沙坦膠囊(80 mg/粒，批號：X0355)，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院西藥房提供；人工氣候箱(RQH-250型)，由上海精宏實驗設(shè)備有限公司提供；動物無創(chuàng)血壓測量儀(BP-100A型)，由成都泰盟科技有限公司提供；大鼠血清CA、NPY、NT、E2、FSH、LH ELISA檢測試劑盒，由上海西唐生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組所有大鼠購回后分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。剔除體質(zhì)量偏離均數(shù)過大的SHR大鼠7只、Wistar大鼠4只。剩余的48只SHR大鼠，按體質(zhì)量大小依次編號1、2、3……48；查閱隨機數(shù)字表，將所得隨機數(shù)字依其出現(xiàn)之先后，按1、2、3……48的順序排列；將末位數(shù)為單數(shù)的對應(yīng)序號的大鼠分配至：中藥組6只、西藥組6只、更年期高血壓對照組(空白對照組)12只、假手術(shù)組12只，將末位數(shù)為偶數(shù)的對應(yīng)序號的大鼠分配至SHR組12只。另選取WKY大鼠6只作為正常對照(WKY組)。6組大鼠的體質(zhì)量、血壓〔WKY組除外，SHR組(184.2±1.9)mm Hg,假手術(shù)組(184.8±2.8)mm Hg,空白對照組(186.9±1.4)mm Hg,西藥組(183.1±2.5)mm Hg,中藥組(183.8±1.6)mm Hg〕水平間有均衡性。

1.3.2更年期高血壓大鼠模型的制備[2]氯胺酮+阿托品+地西泮(0.75 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰位固定大鼠，剪除大鼠腹毛，用碘酒及75%乙醇消毒剪毛處皮膚，于無菌條件下沿腹部正中線自下而上做縱行切口，長1～2 cm，用眼科鑷夾出卵巢，分離脂肪團，即可見黃紅色的卵巢；結(jié)扎輸卵管峽部，切除卵巢，將脂肪組織和子宮角送回腹腔內(nèi)，同法摘除對側(cè)卵巢，兩側(cè)摘除后，將腹膜與肌層分層縫針，用間斷法縫合皮膚，于切口處滴加青霉素液(1 ml，20 U/ml)4～5滴，剩余藥液肌肉注射。術(shù)后連續(xù)3 d，1次/d腹腔注射青霉素(1 ml/100 g)，以防術(shù)后感染。假手術(shù)組只切除卵巢周圍的脂肪組織，不切除卵巢，將卵巢和子宮角送回腹腔內(nèi)，同法摘除對側(cè)卵巢周圍的脂肪組織。造模過程中未出現(xiàn)死亡及造模失敗大鼠。

1.3.3更年期高血壓大鼠成模標準[3]去勢1周后，從以下3方面來判定更年期高血壓大鼠復(fù)合實驗動物模型是否成功。

1.3.3.1去勢大鼠陰道脫落細胞學(xué)檢查評價通過陰道脫落細胞學(xué)檢查，分析大鼠是否有動情周期生理性變化。大鼠動情周期根據(jù)陰道脫落細胞學(xué)檢查結(jié)果可分為4期：(1)動情間期：主要是大量多核白細胞，也有少量上皮細胞；(2)動情前期：有大量上皮細胞，胞質(zhì)呈粒狀，尚有少量角化(無核)的上皮細胞，但無白細胞；(3)動情期：主要是大量角化上皮細胞，形狀大而不規(guī)則，間有少量上皮細胞；(4)動情后期：有大量白細胞，亦有融合的角化上皮細胞。

1.3.3.2血清性激素水平評價比較SHR組、假手術(shù)組、空白對照組血清E2、FSH、LH、睪酮(testosterone,T)、孕酮(progesterone,P)水平差異。

1.3.3.3血壓水平評價比較假手術(shù)組、空白對照組大鼠手術(shù)前后血壓差異。

1.3.4給藥方法給藥劑量：1 ml·100 g-1·d-1，按人/鼠公斤體質(zhì)量的等效劑量換算公式換算(《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》)。給藥時間：于造模成功后每天上午10:00～11:00給藥1次，實驗設(shè)定為60 d。給藥途徑：灌胃給藥。中藥組灌胃虛燥更平散；西藥組灌胃纈沙坦膠囊；余組灌胃0.9%氯化鈉溶液。

2　結(jié)果

2.1更年期高血壓大鼠模型評價

2.1.1陰道脫落細胞學(xué)評價大鼠去勢10 d后，所有去勢大鼠底層細胞均在50%以上，陰道脫落細胞學(xué)檢查僅可見大量白細胞，亦有融合的角化上皮細胞，少有新生成的上皮細胞(見圖1)，說明去勢大鼠已無動情周期變化(符合更年期特征)，證明去勢徹底，造模成功。

注：圖1-1更年期高血壓大鼠卵巢摘除前，圖1-2更年期高血壓大鼠卵巢摘除后第5天，圖1-3更年期高血壓大鼠卵巢摘除后第7天，圖1-4更年期高血壓大鼠卵巢摘除后第10天，圖1-5 SHR大鼠，圖1-6 假手術(shù)組大鼠
圖1大鼠陰道脫落細胞學(xué)檢查結(jié)果(光鏡×200倍)
Figure1Results of vaginal smear cytology

2.1.2血清性激素水平評價SHR組、假手術(shù)組、空白對照組大鼠血清E2、FSH、LH、T、P水平間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與假手術(shù)組、SHR組比較，空白對照組大鼠血清E2、T、P水平明顯下調(diào)，F(xiàn)SH、LH水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.1.3血壓水平評價SHR組、空白對照組大鼠的血壓值手術(shù)前后比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.2虛燥更平散對更年期高血壓大鼠血壓及血壓變異性的影響血壓值組間比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=36.547，P<0.05)；天數(shù)間對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F天數(shù)=41.626，P<0.05)；天數(shù)與組別間交互作用對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在治療前各組(WKY組除外)血壓值對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組治療后5～60 d同一時間點血壓值對比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

6組大鼠的血壓SD間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)，與空白對照組比較，中藥組、西藥組血壓SD明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥組、西藥組、WTY組大鼠的血壓SD比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；空白對照組、SHR組、假手術(shù)組的血壓SD比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表1　SHR組和假手術(shù)組及空白對照組大鼠血清性激素水平比較Table 1　Comparison of serum sex hormone levels of rats in SHR group,fake surgery group and menopause hypertension control group

注：與假手術(shù)組和SHR組比較，*P<0.05；E2=雌二醇，F(xiàn)SH=促卵泡生成激素，LH=促黃體生成激素，T=睪酮，P=孕酮

樣本假手術(shù)組手術(shù)前　　　手術(shù)后空白對照組手術(shù)前　　　手術(shù)后1187 2±4 7180 3±2 9187 6±3 2184 2±3 02189 2±2 8186 5±2 8193 5±3 5182 4±2 63195 5±3 4187 8±3 3195 3±2 5182 5±3 04187 3±3 6178 3±3 8194 5±3 8184 0±4 15192 2±4 3186 5±2 4190 3±4 0183 3±3 66189 3±3 5180 1±3 8192 6±3 3185 1±3 1t值1 4721 306P值0 0850 089

血壓WKY組SHR組假手術(shù)組空白對照組西藥組中藥組治療前118 3±3 2184 2±1 9184 8±2 8186 9±1 4183 1±2 5183 8±1 65d120 3±7 1181 6±6 2181 4±5 4187 2±2 1127 6±9 3138 7±11 510d116 5±7 5175 7±1 5176 0±2 4175 7±1 5121 0±8 2131 0±8 215d122 6±8 2180 5±5 1180 4±5 4185 5±5 1127 1±8 8139 3±11 020d122 9±5 4179 6±4 4179 6±3 2184 6±4 4127 4±6 2137 4±6 225d118 8±8 6180 1±6 0182 1±4 5184 0±4 5123 8±8 6134 9±9 730d116 3±4 9178 4±5 1178 4±4 7182 8±4 5119 5±7 2129 5±7 235d119 1±5 6179 1±3 6179 8±3 2183 5±2 8123 7±6 0133 1±6 640d119 9±5 3177 7±3 2177 9±2 6182 7±3 2124 9±5 2132 9±5 245d121 2±5 4179 6±2 4179 6±1 9184 6±2 4125 7±6 2135 7±6 250d117 1±5 5177 1±1 5175 6±1 6182 1±1 5122 1±5 5129 0±6 655d115 1±4 6176 8±1 4175 9±1 3181 8±1 4120 1±4 6126 5±6 960d117 6±4 4176 8±4 0177 3±3 9181 2±3 3122 6±4 4129 5±5 8

表4　6組大鼠血壓變異性比較Table 4　Comparison of blood pressure variability in six groups

注：SD=標準差；與空白對照組比較，△P<0.05

2.3虛燥更平散對更年期高血壓大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)指標的影響6組大鼠的血清CA、NPY、NT水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組比較，中藥組、西藥組CA、NPY、NT水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組CA、NPY、NT水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5　6組大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)指標水平比較Table 5　Comparison of serum neurotransmitters in six group rats

注：CA=兒茶酚胺，NPY=神經(jīng)肽，NT=神經(jīng)降壓素；與空白對照組比較，▲P<0.05

2.4虛燥更平散對更年期高血壓大鼠血清內(nèi)分泌指標的影響6組大鼠的E2、FSH、LH水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組比較，中藥組的E2水平下調(diào)，F(xiàn)SH、LH水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥組與空白對照組的E2、FSH、LH水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。SHR組與假手術(shù)組的E2、FSH、LH水平比較，差異亦均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

表6　6組大鼠血清內(nèi)分泌指標水平比較Table 6　Comparison of serum endocrine in six groups

注：與空白對照組比較，▲P<0.05

3　討論

BPV是指一定時間內(nèi)的血壓波動程度，是體內(nèi)神經(jīng)-內(nèi)分泌動態(tài)調(diào)節(jié)綜合平衡的結(jié)果，是人類血壓最基本的生理特征之一[4]。自主神經(jīng)系統(tǒng)是影響和調(diào)控BPV的重要機制，BPV主要反映交感和迷走神經(jīng)對心血管調(diào)節(jié)的動態(tài)平衡[5]，其次中樞神經(jīng)系統(tǒng)及體液內(nèi)分泌也是參與和形成BPV的主要機制。

目前針對更年期高血壓發(fā)病內(nèi)在機制的研究未涉及動物實驗研究，而更年期綜合征、高血壓等疾病實驗動物模型的建立為更年期高血壓病復(fù)合實驗動物模型的研究提供了極其寶貴的經(jīng)驗。SHR大鼠與人類原發(fā)性高血壓病形成機制有相似之處，血壓的升高均與外周血管阻力的增加有關(guān)，且對抗高血壓藥物有反應(yīng)，因此，它是人類原發(fā)性高血壓病研究及高血壓病藥物篩選較為理想的動物模型[6]。本實驗造模結(jié)果顯示，去勢大鼠已無原有動情周期生理性變化，去勢徹底；與假手術(shù)組、SHR組比較，更年期高血壓大鼠血清E2、T、P水平明顯下調(diào)，F(xiàn)SH、LH水平明顯上調(diào)，符合更年期特征。更年期高血壓大鼠手術(shù)前后血壓無明顯變化，提示摘除卵巢對SHR大鼠的刺激并未影響其血壓變化，從另一角度佐證了更年期卵巢功能急劇下降，導(dǎo)致神經(jīng)、內(nèi)分泌等內(nèi)環(huán)境紊亂，造成血壓波動增大的病理改變，從而確定更年期高血壓實驗動物模型造模成功。另一方面異常BPV能在血管壁上形成異常的環(huán)形張力和縱向剪切力，直接損害血管內(nèi)皮，引起血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，Sander等[7]研究顯示，收縮壓變異是頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)進展的最好預(yù)測指標。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，中藥組、西藥組血壓明顯降低，BPV明顯減小，提示虛燥更平散對更年期高血壓大鼠有降低血壓，減少BPV的作用。究其原因考慮，更年期高血壓大鼠交感神經(jīng)張力增高，血壓易受應(yīng)激因素影響而波動，虛燥更平散所含中草藥具有補益沖任、疏肝解郁、養(yǎng)血安神、寧心潤燥之功效，能夠透入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過阻滯中樞β受體，使興奮性神經(jīng)元活動減弱，造成外周交感神經(jīng)張力降低，從而降低血壓。灌服虛燥更平散后，中藥組BPV降低，考慮虛燥更平散可以調(diào)節(jié)更年期高血壓大鼠中樞神經(jīng)功能，增加動脈壓力反射敏感性，提高緩沖和平衡血壓波動的能力，從而使BPV平穩(wěn)降低。

基于新疆地藥、民藥組方而成的虛燥更平散治療更年期高血壓，經(jīng)過多年臨床應(yīng)用，達到滿意療效，現(xiàn)已成為我院院內(nèi)制劑。本研究結(jié)果進一步驗證，虛燥更平散可有效降低更年期高血壓大鼠的血壓、減少BPV、調(diào)節(jié)更年期高血壓大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及內(nèi)分泌指標；建立更年期高血壓大鼠復(fù)合實驗動物模型，從實驗研究入手，可以進一步研究更年期高血壓的發(fā)病機制，為中醫(yī)藥防治更年期高血壓奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1Devereux RB,Pickering TG.Relationship between the level,pattern and variability of ambulatory blood pressure and target organ damage in hypertension[J].Hypertens,1991:9(1):S34.

2駱仲達.針刺結(jié)合腹診推拿對更年期綜合征大鼠模型生殖-內(nèi)分泌影響的研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2010,16(5):423-424.

3洪潤肖.補糖干預(yù)對動情周期抑制大鼠HPT軸及HPA軸結(jié)構(gòu)和功能的影響[D].上海體育學(xué)院,2011年.

4Mancia G,Grassi G.Mechanisms and clinical implications of blood pressure variability[J].Cardiovasc Pharmacol,2000,35(7):515-519.

5Parati G,Faini A,Valentini M.Blood pressure variation:its measurement and significance in hypertension[J].Curr Hypertens Rep,2006,13(8):199-204.

6郭雪微,王雪里紅,高志凌.血漿神經(jīng)肽Y神經(jīng)降壓肽水平與高血壓患者血壓晝夜變化和靶器官損害的研究[J].中華心血管病雜志,2005,33(11):1006-1009.

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