孔令韜，胡 賢，吳 楓，湯艷清

名詞解釋開場試驗：開場試驗是通過測量動物進入開闊環(huán)境后的各種行為，來觀察研究動物神經(jīng)精神變化情況，被廣泛應(yīng)用于動物行為學、腦功能及藥物對動物行為影響等方面的研究。在開場試驗箱中，試驗箱場地被劃分成數(shù)個固定大小的開場格，動物被放入箱內(nèi)后由于對新環(huán)境的恐懼和其探究本性會在箱中不斷活動和探索，可以通過對其相關(guān)行為的評估來評價動物抑郁或焦慮情緒。

抑郁癥是以心境低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀為主要臨床表現(xiàn)的常見精神疾病[1]。盡管近年來抑郁癥在治療方面已經(jīng)取得了很大進展，但是對抑郁癥發(fā)病的生物學基礎(chǔ)及抗抑郁藥物起效的具體機制等仍不清楚。應(yīng)激性生活事件被認為是導致抑郁癥發(fā)病的高風險因素[2]，海馬作為介導應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)，發(fā)現(xiàn)其在抑郁癥患者中存在結(jié)構(gòu)和功能上異常[3-4]。有研究表明，抑郁癥患者存在海馬神經(jīng)元體積和密度的降低[5]，認為可能與應(yīng)激導致的海馬神經(jīng)元損傷和凋亡增加有關(guān)[6]。近年來，碳酸鋰作為抗抑郁藥物的增效劑被應(yīng)用于難治性抑郁癥的治療并取得良好效果，但其作用的分子機制仍不十分清楚。有研究認為，碳酸鋰可能通過上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)的表達發(fā)揮其抗抑郁作用[7]。本研究擬進一步觀察與凋亡密切相關(guān)的兩種蛋白Bcl-2和細胞色素C在慢性應(yīng)激性抑郁模型大鼠海馬中的表達及碳酸鋰對其影響，探討海馬神經(jīng)元凋亡在抑郁癥發(fā)病機制中的作用及抗抑郁藥物的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 普通級青年雄性Wistar大鼠45只，2～3月齡，體質(zhì)量180～220 g，健康狀況良好，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(遼)2003-0013。飼養(yǎng)條件：自由飲食水，光暗周期為12/12 h,實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。用隨機排列表法分為3組(每組15只)：正常對照組、抑郁模型組和碳酸鋰組。

1.1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠Bcl-2抗體(Santa Cruz Co.)，兔抗大鼠細胞色素C抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，生物素標記的兔抗小鼠IgG，山羊抗兔IgG，ECL試劑盒(Santa Cruz Co.)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 入組后第1～21天，對照組大鼠正常飼養(yǎng)；模型組和碳酸鋰組大鼠隨機接受7種不同的刺激：電擊足底(30～40 V,20 s/次，間隔1 min，共20次)；強迫游泳(水溫20 ℃,5 min)；夾尾(1 min)；搖晃(水平往復，1次/s，共15 min)；熱應(yīng)激(45 ℃溫箱，5 min)；禁食(48 h)；禁水(24 h)。每天隨機給予一種刺激，每種刺激累計使用2～3次[8]。

1.2.2 行為學指標觀察 制備模型前后，對各組動物進行開場試驗測定大鼠5 min 內(nèi)的行為表現(xiàn)，包括水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)等。制備模型前后，對各組大鼠進行液體消耗實驗，計算24 h 內(nèi)蔗糖水消耗百分比(糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.2.3 藥物干預 將碳酸鋰片劑(250 mg/片)研磨成粉，溶于蒸餾水。第1～21天，每天應(yīng)激前，碳酸鋰組灌胃碳酸鋰60 mg/kg，模型組和對照組灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.4 腦組織處理及Western-blot法測定海馬Bcl-2和細胞色素C的表達 第22天，將大鼠斷頭處死，迅速取腦剝離海馬組織，置于4 ℃環(huán)境中，加入300 μl裂解液勻漿并離心1 h，吸取上清液，進行免疫印跡測定。具體步驟如下：考馬斯亮藍G250法測定蛋白濃度后加入樣品緩沖液調(diào)節(jié)樣品蛋白濃度；灌膠，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉封閉液中4 ℃過夜；分別加入Bcl-2抗體(1∶200)或細胞色素C抗體(1∶200)，搖床上室溫孵育2 h；加入按1∶400稀釋的辣根過氧化物酶結(jié)合的IgG，搖床上室溫孵育2 h；ECL法顯色；曝光，顯影，定影。Western blot法測定結(jié)果用Chemi Imager 5500 V2.03軟件掃描，再用Fluor Chen2.0軟件定量分析測得整合光密度值(IDV)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠慢性應(yīng)激前后行為學指標的比較 慢性應(yīng)激前3組大鼠的水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)和糖水消耗百分比比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。慢性應(yīng)激21 d后，3組大鼠的水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)和糖水消耗百分比比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中模型組和碳酸鋰組水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)、糖水消耗百分比均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；碳酸鋰組的水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)及糖水消耗百分比與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

2.2 Western-blot法測定海馬Bcl-2和細胞色素C表達 慢性應(yīng)激后3組大鼠海馬Bcl-2和細胞色素C的表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中模型組大鼠海馬Bcl-2的表達水平低于對照組，細胞色素C的表達水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；碳酸鋰組大鼠海馬細胞色素C的表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而Bcl-2的表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；碳酸鋰組大鼠海馬Bcl-2的表達水平高于模型組，細胞色素C的表達水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表2)。

表1 3組大鼠慢性應(yīng)激前后開場試驗行為及糖水消耗比較

注：與對照組比較，△P<0.05

Table2 Comparison of expression of Bcl-2 and cytochrome C among 3 groups

組別數(shù)量Bcl-2(IDV值)細胞色素C(IDV值)對照組1544339±3424 24631±2194 模型組1536162±5332?38963±5384? 碳酸鋰組1542605±5409△34377±3840?△F值12 03349 649P值<0 05<0 05

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

3 討論

慢性不可預見性應(yīng)激(CUMS)抑郁模型[8]采用輕度、不可預見的應(yīng)激因子模擬人類生活事件和環(huán)境應(yīng)激刺激等心理社會因素，其理論依據(jù)與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源促進疾病發(fā)生、加速疾病發(fā)展的機制更接近，是近年來國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的探討抑郁癥發(fā)病機制及抗抑郁藥物藥理學作用的動物模型之一。本研究中，模型組大鼠經(jīng)過21 d慢性綜合應(yīng)激，與對照組相比活動能力降低、探究行為減少、修飾次數(shù)減少以及糖水消耗百分比下降，這些表現(xiàn)與臨床抑郁癥患者所表現(xiàn)的精神運動改變、興趣或快感的喪失有很大程度的相似性，以上結(jié)果說明本研究中大鼠抑郁癥模型的制作是成功的[9]。

凋亡是維持體內(nèi)細胞動態(tài)平衡的一種基本現(xiàn)象，是成年生物體內(nèi)清除病變和衰老細胞，保持機體健康和內(nèi)環(huán)境平衡的重要生物過程。Bcl-2是細胞內(nèi)重要的抗凋亡蛋白之一，主要存在于線粒體外膜上，在正常細胞中起到抑制線粒體內(nèi)細胞色素C等促凋亡蛋白釋放，防止凋亡發(fā)生的作用。當細胞遭受應(yīng)激反應(yīng)或凋亡信號刺激后，細胞質(zhì)內(nèi)的促凋亡蛋白被激活并與Bcl-2結(jié)合使其喪失對細胞凋亡的抑制作用，導致線粒體內(nèi)的細胞色素C被釋放到細胞質(zhì)中，細胞色素C的釋放能夠激活內(nèi)源性細胞凋亡途徑并最終導致細胞凋亡[10]。既往已有Lucassen等[11]研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可能導致海馬神經(jīng)元凋亡增加，而本研究結(jié)果表明，在慢性應(yīng)激導致的抑郁癥模型中，模型組大鼠海馬Bcl-2表達較對照組降低，細胞色素C表達較對照組增加，表明長時間的慢性應(yīng)激可能激活海馬神經(jīng)元內(nèi)促凋亡蛋白與Bcl-2的結(jié)合，導致Bcl-2表達減少及線粒體內(nèi)細胞色素C釋放的增多，這可能是慢性應(yīng)激導致海馬神經(jīng)元凋亡及海馬功能損害的內(nèi)在途徑之一。

碳酸鋰是治療急性雙相抑郁障礙的一線藥物，同時也被作為抗抑郁藥物的增效劑用于單相抑郁發(fā)作的治療，能夠增強抗抑郁藥物的治療效果[12]。本研究中，碳酸鋰組大鼠行為學表現(xiàn)優(yōu)于模型組大鼠，提示碳酸鋰能夠有效改善慢性應(yīng)激導致的大鼠抑郁行為。有研究報道碳酸鋰可以提高正常大鼠海馬Bcl-2的表達，認為這可能與碳酸鋰抗抑郁作用有關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，碳酸鋰能夠提高慢性應(yīng)激性抑郁模型大鼠海馬Bcl-2的表達，同時降低細胞色素C的表達，提示碳酸鋰可能通過參與對凋亡途徑中相關(guān)蛋白表達的調(diào)控來減少應(yīng)激導致的神經(jīng)元凋亡，這種神經(jīng)元保護作用可能是碳酸鋰發(fā)揮其抗抑郁作用的藥理學機制之一。但是我們也注意到，在對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控中，碳酸鋰對Bcl-2的影響要強于對細胞色素C的影響，這意味著盡管碳酸鋰對凋亡上游抗凋亡蛋白的表達有很好的上調(diào)作用，但仍無法完全抑制神經(jīng)元凋亡過程的發(fā)生。這可能與細胞凋亡過程調(diào)控的復雜性有關(guān)：除了Bcl-2之外，細胞內(nèi)其他凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-xl、Bax等也都參與了對細胞凋亡的調(diào)控[14-15]，而碳酸鋰對他們的影響尚不清楚，這也可能是導致碳酸鋰不能完全改善慢性應(yīng)激導致的大鼠行為改變的原因之一。

綜上所述，本研究認為慢性應(yīng)激導致海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達的變化可能是抑郁癥發(fā)病的內(nèi)在機制之一，碳酸鋰對相關(guān)蛋白的調(diào)控可能是其發(fā)揮抗抑郁療效的靶點之一，但由于細胞凋亡的過程比較復雜，參與對細胞凋亡調(diào)控的蛋白種類較多，凋亡與抑郁癥發(fā)病及治療的關(guān)系仍有待于今后的進一步研究。

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(1)作者貢獻：此課題由孔令韜和吳楓共同設(shè)計；研究過程由孔令韜、胡賢及吳楓操作完成；研究所用新試劑及分析工具由湯艷清提供；數(shù)據(jù)分析由孔令韜完成；本論文寫作由孔令韜及吳楓完成。

(2)作者聲明：文章為原始作品，數(shù)據(jù)準確，內(nèi)容不涉及泄密，無一稿兩投，無抄襲，無內(nèi)容剽竊，無作者署名爭議，無與他人課題及專利技術(shù)的爭執(zhí)。內(nèi)容真實，文責自負。

(3)利益沖突：課題未涉及任何廠家及其他經(jīng)濟組織直接或間接的經(jīng)濟或利益的贊助。

(4)倫理要求：實驗過程中對動物的處置符合中國醫(yī)科大學倫理委員會相關(guān)動物倫理學標準。

(5)研究的背景資料：海馬神經(jīng)元損害和凋亡與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)，抗抑郁藥物可能通過抑制相關(guān)神經(jīng)元凋亡來發(fā)揮作用。

(6)文章要點：用慢性不可預見性應(yīng)激方法建立大鼠抑郁模型并在造模過程中給予碳酸鋰治療，用Western-blot法測定大鼠海馬中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和細胞色素C的表達情況及碳酸鋰對其影響。

(7)研究的創(chuàng)新之處與不足：創(chuàng)新之處：探討碳酸鋰作為抗抑郁藥物的增效劑在抑制海馬神經(jīng)元凋亡過程中的作用機制。不足：樣本數(shù)較少，觀察時間較短。

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