郝 苗，齊鳳杰，馬 玲

14-3-3已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是廣泛分布于多種生物體中的一種高度保守的可溶性酸性蛋白家族,在1967年時由Moore 和Perez對牛腦蛋白系統(tǒng)分類時首次發(fā)現(xiàn),共分為7個亞型,有不同的基因編碼[1]。隨著克隆技術(shù)的發(fā)展及14-3-3 cDNA 文庫的建立,人們對該蛋白的生物學(xué)特性及其功能有了較全面且深入的認(rèn)識。14-3-3 以同源或異源二聚體的形式存在,與多種細(xì)胞蛋白等結(jié)合并相互作用。14-3-3σ是14-3-3家族中的重要成員，并且是14-3-3家族中惟一能夠被DNA損傷所誘導(dǎo)的成員。大量研究表明，14-3-3σ是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，它的活化可以使細(xì)胞周期停滯于G2/M期，從而抑制細(xì)胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3σ的表達下調(diào)能夠使人上皮細(xì)胞無限制地增殖[2]，這就說明了14-3-3σ表達的降低有助于腫瘤的形成，促進細(xì)胞的無限增殖。14-3-3σ在正常的乳腺上皮細(xì)胞呈高表達，而在許多種癌中表達下調(diào)，包括乳腺癌、宮頸癌、胃癌。

但是14-3-3σ如何調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展，14-3-3σ的表達是否與腫瘤的惡性程度相關(guān)，目前還不是特別清楚。14-3-3σ在人乳腺癌細(xì)胞中的表達下降被認(rèn)為是乳腺癌發(fā)生的一個重要原因之一，所以其可以作為人類乳腺上皮癌變的一個特異性標(biāo)記[3]。本研究旨在通過構(gòu)建攜帶增強綠色熒光蛋白基因的14-3-3σ真核表達載體及由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細(xì)胞,觀察其蛋白轉(zhuǎn)位,為下一步研究14-3-3σ穩(wěn)定表達對乳腺癌發(fā)展的影響提供實驗工具。

1 材料與方法

1.1 工具酶和試劑 乳腺癌MCF-7細(xì)胞,胎牛血清(杭州四季青),1640培養(yǎng)基(GIBCO公司),DNAmarker、內(nèi)切酶BamH I、HindⅢ、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒大量提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒(TaKaRa公司),脂質(zhì)體2000和G418(GIBICO公司),小鼠抗人14-3-3σ單克隆抗體、β-actin一抗(Santa Crut公司),磷酸鹽緩沖液(PBS)、TBE緩沖液、LB培養(yǎng)基(實驗室自配)，攜帶增強綠色熒光重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-GV418(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及總RNA的提取 根據(jù)GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的mRNA 序列(登錄號：NM011740)設(shè)計帶酶切位點的人14-3-3 基因的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)引物。正向引物為：5′-CGAATTCCCATGGAGAGAGCCAGTCTGA-3′(下劃線部分為BamH Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶位點)，反向引物為：5′-GGGGATCCCAGCTCTGGGGCTCCTGG-3′(下劃線部分為HindⅢ限制性核酸內(nèi)切酶位點)。引物合成委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。總RNA的提取與RT-PCR：從HeLa細(xì)胞中提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄酶TaKaRa公司的說明書進行RT-PCR擴增獲得編碼14-3-3 的cDNA序列，PCR擴增反應(yīng)體系如下：12.5 μl的2 ×GC buferI、2.5 μl dNTP、正義鏈/反義鏈引物(20 μmol/L)各1.25 μl、cDNA模板1 μl、PyrobestDNA polymerase 0.15 μl、加去離子水至25 μl。擴增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 rain，94 ℃變性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，反應(yīng)30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物命名為SFN，長度747 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.2 克隆載體pCUm-GV142-SFN的構(gòu)建、鑒定和序列測定 用BamHⅠ和HindⅢ 酶切備用的PCR 產(chǎn)物,膠回收純化后與同樣酶切的pEGFP-N1真核表達質(zhì)粒在T4連接酶作用下16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a后,取足量菌體涂布于含氨芐西林的LB平板,37 ℃過夜培養(yǎng)。隔日,挑取數(shù)個陽性菌落于含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中,50 ml搖菌管37 ℃振搖過夜,質(zhì)粒小抽。用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切和PCR初步鑒定陽性細(xì)菌克隆。將酶切鑒定和PCR正確的細(xì)菌克隆所得質(zhì)粒經(jīng)酶切后以1% 的瓊脂糖電泳初步分析及酶切鑒定后,送上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒經(jīng)大量擴增后,用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒,定量后用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.3 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞系 乳腺癌MCF-7細(xì)胞在含10 %(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、青霉素、鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5 %(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳(CO2)的飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%時按照LipofectamineTM2000 操作說明書進行空質(zhì)粒pEGFP-N1 和重組表達載體pCUm-GV142-SFN 的轉(zhuǎn)染。在24孔培養(yǎng)板上,以無血清無雙抗的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后進行轉(zhuǎn)染步驟：(1)按影響轉(zhuǎn)染效率的鋪板密度(1×104/孔、2×104/孔和4×104/孔)；(2)鋪板密度為2×104/孔,固定質(zhì)粒用量1 μg,作用時間4 h,使用不同量的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染(1、2、3、5、8和10 μl)；(3)孵育時間;鋪板密度為2×104/孔,質(zhì)粒用量0.5 μg,脂質(zhì)體用量4 μl,使用不同的孵育時間(2、4、6和8 h),逐一優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染，4 h后換成完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48 h,熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，在含有G418(700 μg/ml) 的選擇性培養(yǎng)基中加壓篩選6 周,獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克隆,擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達14-3-3σ的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系,命名為MCF-7GV142細(xì)胞。

1.2.4 Western blot法檢測14-3-3σ表達 轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞,裂解后提取總蛋白，取20 μg 處理后的蛋白樣品，用BCA蛋白定量試劑盒定量后進行12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,50 g/L脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h,與1∶200 稀釋后的一抗(鼠抗人14-3-3 單克隆抗體，鼠抗人B-Aetin單克隆抗體)4 ℃孵育過夜,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次,10 min/次,然后與1∶5 000 稀釋后的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育2 h,PBST 洗膜3次,10 min/次，最后采用增強化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 特異性條帶的獲得 提取HeLa細(xì)胞總RNA，RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后得到一條大約800 bp位置的特異條帶,與14-3-3 cDNA 的大小完全一致(見圖1)。

注：M：Marker，1：14-3-3σ RT-PCR擴增產(chǎn)物

圖1 人14-3-3σ RT-PCR擴增產(chǎn)物的鑒定

Figure1 Identification of PCR amplified products of 14-3-3 σ

2.2 真核表達載體pCMV-GV142-SFN的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pCMV-GV142-SFN用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,得到一條774 bp的目的條帶(見圖2)。證明目的基因已正確插入質(zhì)粒GV142,得到了真核表達載體pCMV-GV142-SFN。

圖2 酶切鑒定

2.3 DNA序列分析 所獲質(zhì)粒經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序并與GenBank公布的序(NM_006142.3)比對,同源性100%,無堿基突變(見圖3)。

2.4 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞 據(jù)優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件,將攜帶GV142的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳腺癌MCF-7靶細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染24 h后,乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)可見增強綠色熒光蛋白表達,48 h表達最穩(wěn)定,72 h可見熒光蛋白淬滅,細(xì)胞形態(tài)逐漸消失(見圖4)。

2.5 Western blot 檢測結(jié)果 乳腺癌MCF-7細(xì)胞克隆中GV142蛋白表達，所構(gòu)建的真核表達載體已在乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)表達(見圖5)。

圖3 測序鑒定圖

A：轉(zhuǎn)染24 h后,乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)可見增強綠色熒光蛋白表達,B：48 h表達最穩(wěn)定,C：72 h可見熒光蛋白淬滅

圖4 熒光顯微鏡觀察所示

Figure4 Results by fluorescence microscope

注：A未轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，B轉(zhuǎn)染陰性乳腺癌細(xì)胞，C轉(zhuǎn)染陽性乳腺癌細(xì)胞

圖5 Western blot 檢測結(jié)果

Figure5 Western blot test results

3 討論

14-3-3通過與其他數(shù)百種磷酸化或非磷酸化蛋白結(jié)合而發(fā)揮其獨特的作用。14-3-3σ是14-3-3家族中的重要一種，因能特異地表達于上皮細(xì)胞，故被稱為人類上皮細(xì)胞標(biāo)志物[4]。作為細(xì)胞周期檢查點的基因家族成員，負(fù)責(zé)DNA的損傷修復(fù)。在正常細(xì)胞周期信號通路傳導(dǎo)路徑中起著重要效用[5]。在細(xì)胞周期中，14-3-3σ位于抑癌基因p53的上游，二者起正性調(diào)節(jié)作用。其產(chǎn)物可與多種信號蛋白包括磷酸酶、激酶或跨膜蛋白等相互作用[6]，在細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、死亡及遷移中發(fā)揮重要作用，有文獻報道14-3-3 受到多種轉(zhuǎn)錄因子的直接調(diào)控，通過以下3種可能途徑影響轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用：(1)14-3-3σ與轉(zhuǎn)錄因子相螯合影響了轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的DNA結(jié)合；(2)14-3-3σ與轉(zhuǎn)錄因子相螯合影響了轉(zhuǎn)錄因子自身的蛋白水解；(3)14-3-3σ與轉(zhuǎn)錄因子相螯合影響了轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白的相互作用[7-9]。目前，國內(nèi)未見人源性14-3-3σ真核表達載體在乳腺癌中作用機制的相關(guān)研究[10]。本研究從HeLa細(xì)胞總RNA中獲得編碼14-3-3σ的cDNA，將其克隆入pEGFP-N1載體，構(gòu)建了人源性14-3-3σ真核表達載體pCMV-GV142-SFN。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將pCMV-GV142-SFN載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，Western blot證實轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)14-3-3σ的表達明顯增高。這為研究14-3-3σ的功能提供了必要條件，為以后進一步研究14-3-3σ與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系以及14-3-3σ與轉(zhuǎn)錄因子相互作用在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的機制研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

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