王靜 張艷 胡鈺卿 竺祖軍 岳永寧 朱敏

環(huán)介導等溫擴增技術在檢測痰標本結核分枝桿菌中的應用

王靜 張艷 胡鈺卿 竺祖軍 岳永寧 朱敏

目的 評價結核分枝桿菌環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）快速檢測試劑盒的臨床應用效果。方法選取肺結核患者183例（肺結核組）和非肺結核患者120例（對照組）。采用涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)法和LAMP對痰標本進行檢測，采用結核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒（TB-PCR）檢測羅氏培養(yǎng)與LAMP結果不符的標本，分析LAMP與羅氏培養(yǎng)的檢出率及兩者的符合率。結果去除經(jīng)鑒定為非結核分枝桿菌的10例標本，涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)法和LAMP的陽性檢出率分為64.1%（111/173）、64.7%（112/173）、78.6%（136/173）。LAMP與抗酸染色、羅氏培養(yǎng)陽性檢出率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）,抗酸染色與羅氏培養(yǎng)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以羅氏培養(yǎng)為金標準，LAMP檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為88.5%（108/122）、82.3%（149/181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163），LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)的符合率為84.8%（257/303）。結論結核分枝桿菌環(huán)介導等溫擴增技術的靈敏度和特異度高，具有簡單易行、快速準確的特點,在肺結核患者的早期診斷中將發(fā)揮重要作用。

結核分枝桿菌 環(huán)介導等溫擴增技術 痰

早期準確和廉價的檢測診斷技術在結核病的預防、診斷、治療中有著非常重要的作用。環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplication,LAMP）是近幾年研究較多的恒溫擴增方法，國內(nèi)外實驗室已進行了相關研究[1-3]。本實驗室引進最近在國內(nèi)研發(fā)的LAMP恒溫擴增商品試劑盒，筆者通過評估其應用效果，旨在探求一種敏感、準確、快速、低成本、方便操作的方法。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2011-06—10我院結核病治療中心住院的肺結核患者183例（其中初治141例，復治42例），男125例，女58例，年齡18～88歲，平均（53±21）歲。所有對象均經(jīng)臨床表現(xiàn)、胸部X線、CT檢查及痰液抗酸染色等確診。選擇同期在我院呼吸科住院的非結核患者120例，男90例，女30例，年齡18～97歲，平均（69±19）歲。其中肺癌22例,矽肺14例,慢性阻塞性肺氣腫18例及慢性支氣管炎20例,其它各類肺炎46例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 痰標本采集 囑患者漱口后留早晨第一口痰。

1.2.2 抗酸染色 按照文獻[4]進行。

1.2.3 羅氏培養(yǎng)及菌株菌型鑒定 按照文獻[4]操作。對于羅氏培養(yǎng)陽性菌株使用對硝基苯甲酸（PNB）鑒別培養(yǎng)基（500μg/ml）進行分型，區(qū)分結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌。培養(yǎng)基購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術有限公司（批號20110625和20110901）。

1.2.4 LAMP檢測 結核分枝桿菌核酸快速檢測試劑盒由廣州華峰生物科技有限公司提供(批號:20110409)。試劑盒包含4條LAMP引物,引物序列為FIP：ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGTTTTAGAAGTCGGAACCCCT；BIP：ATACGACTTCGAAACCGTCGCCTTTTGGTCAGCCCCTTGTTGAG，F(xiàn)3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT。引入SYBR GreenI核酸染液，直接用肉眼對實驗結果判定[5]。

1.2.4.1 痰液樣本DNA的制備 （1）初步估計痰樣本量,加入4倍體積4%氫氧化鈉溶液,充分混勻,室溫靜置液化30min；（2）吸取1ml液化痰加入1.5ml無菌離心管中，15 000r/min離心5min，吸棄上清液；（3）沉淀使用1ml 0.9%氯化鈉溶液重懸洗滌，15 000r/min離心5 min，棄上清液；（4）采用1ml 0.9%氯化鈉溶液重懸洗滌，15 000r/min離心5min，棄上清液，沉淀用于模板提??；（5）分別加入100μl DNA提取液Ⅰ和0.25μl Proteinase K，56℃溫浴30 min，再沸水浴10 min；（6）加入12.5μl DNA提取液Ⅱ，稍混勻，12 000r/min離心5min，上清液即為DNA模板。

1.2.4.2 LAMP擴增反應 （1）在解凍后的HF管內(nèi)按順序分別加入陰性對照模板、待測標本模板和陽性對照模板各2.5μl；（2）放置65℃水浴箱恒溫反應60min；（3）反應結束后使反應管冷卻，顛倒混勻HF管。

1.2.4.3 結果判讀 （1）若待檢樣品反應管液體變?yōu)榫G色，說明該管發(fā)生了特異性擴增，為結核分枝桿菌陽性；（2）若待檢樣品反應管液體仍為橙色，說明未發(fā)生特異性擴增，為結核分枝桿菌陰性。

1.3 結核分枝桿菌核酸擴增熒光體外檢測（TB-PCR）當同樣的標本羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結果不一致時，采用TB-PCR對備份樣品進行檢測。試劑盒購自深圳匹基生物工程有限公司（批號：20110307）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。以羅氏培養(yǎng)基檢測結果為金標準，計算LAMP檢測的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。陽性檢出率組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 肺結核組3種檢測方法陽性率的比較 肺結核組羅氏培養(yǎng)陽性122例，所有陽性菌株均經(jīng)PNB培養(yǎng)基進行結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌鑒定，其中LAMP陰性培養(yǎng)陽性的10例痰標本為非結核分枝桿菌（未進行進一步分型）。剩余的173例標本中，抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、LAMP的陽性檢出率分別為64.1%（111/173）、64.7%（112/173）、78.6%（136/173），LAMP試驗與抗酸染色陽性檢出率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 8.84，P＜0.01），與羅氏培養(yǎng)法的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.20，P＜0.01），抗酸染色法與羅氏培養(yǎng)的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.02，P＞0.05）。

2.2 兩組患者LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)檢測結果比較肺結核組122例羅氏培養(yǎng)陽性中LAMP檢測陽性108例，陰性14例；61例羅氏培養(yǎng)陰性中LAMP檢測陽性28例，陰性33例。對照組120例痰標本中，羅氏培養(yǎng)均為陰性，LAMP檢測陽性4例。以羅氏培養(yǎng)為金標準，LAMP檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為 88.5%（108/122）、82.3%（149/181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163），LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)的符合率為84.8%（257/303）。

2.3 TB-PCR檢測結果 兩組患者的痰標本中羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結果不符的標本共46例，其中34例LAMP檢測結果與TB-PCR檢測結果一致，詳見表1。

表1 羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結果不一致的標本

3 討論

為了尋找快速靈敏的結核病感染檢測診斷方法,目前已有多種核酸擴增方法，如羅氏公司Amplicor檢測系統(tǒng)[6]、Genprobe的rRNA擴增結核分枝桿菌直接反應（AMTD）[7]、連接酶鏈式反應[8]、Q-β復制酶擴增法[9]、鏈置換擴增法[10]，但以上基因學檢測方法都需要昂貴的儀器設備以及實驗室條件，限制了這些方法的廣泛應用。

LAMP檢測是近年發(fā)展起來的核酸體外擴增技術，該方法最初是由Notomi等[11]設計用于病原微生物的檢測，其針對靶基因的6個區(qū)段，在一個恒定65℃下即可完成擴增，可一步完成基因的擴增和產(chǎn)物的檢測，并在15～60min內(nèi)擴增109～1 010倍，擴增效率極高,擺脫了特殊儀器的限制，操作更加的簡單、方便，適合大量樣品高通量檢測，通過判別擴增產(chǎn)物的有無來對靶基因序列進行檢測，結果判斷簡單，可通過比濁法[4]和紫外線法兩種方法進行。

本研究顯示，LAMP檢測的陽性率（78.6%）明顯高于抗酸染色法（64.1%）、羅氏培養(yǎng)（64.7%）。以羅氏培養(yǎng)為金標準，LAMP檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為88.5%（108/122）、82.3%（149/ 181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163），LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)的符合率為84.8%（257/303），與國外文獻報道基本相似[1-3]。由于羅氏培養(yǎng)陽性菌株中包括MTB和NTB，因此其特異度較低；另外，由于羅氏培養(yǎng)的營養(yǎng)條件等因素的限制,檢測臨床標本的MTB敏感度偏低。上述缺點導致本方法與羅氏培養(yǎng)檢測結果符合率偏低問題。本研究選用TB-PCR試劑盒，對羅氏培養(yǎng)和LAMP檢測結果不符的標本進行第3方檢測評價，TBPCR試劑盒作為MTB檢測試劑，具有較高的靈敏度和特異度。在46例羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結果不符的標本中，34例LAMP與TB-PCR檢測結果相符。

本研究發(fā)現(xiàn)了LAMP檢測過程從樣品制備到結果報告,所需時間短，僅需3h，通過肉眼可迅速觀察到實驗結果，并且可以較準確地對標本中是否含有結核分枝桿菌復合群做出快速鑒定，為臨床醫(yī)師對肺結核患者早期診斷和鑒別診斷提供了重要依據(jù)。因此，LAMP恒溫擴增技術具用高靈敏度、高特異度、操作簡單、設備要求低、實驗人員快學易接受等優(yōu)點，在經(jīng)濟條件欠發(fā)達的發(fā)展中國家具有巨大的發(fā)展前景。

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Evaluation of loop-mediated isothermal amplification in direct detection mycobacterium tuberculosis DNA of sputum samples

ObjectiveTo assess the clinical use of the loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay for detection mycobacterium tuberculosis in sputum samples.MethodsLAMP with acid-fast bacilli(AFB)smear microscopy and Lowenstein-Jensen(L-J)culture,were performed in 183 sputum specimens from pulmonary tuberculosis patients and 120 sputum specimens from non-pulmonary tuberculosis patients.The samples with different results between LAMP and L-J culture were tested by mycobacterium tuberculosis PCR fluorescence diagnostic kits.L-J culture positive strains were identified by p-Nitrobenzoic acid medium.The sensitivity and specificity of LAMP were calculated according to the result of L-J culture.The detection rates of the 3 methods were analyzed according to the clinical diagnosis and the differences were analyzed by chi-square test.ResultsFor tuberculosis patient(removing 10 samples caused by NTM),the detection rate of AFB,L-J culture and LAMP were 64.1%(111/173)、64.7%(112/173)、78.6%(136/173),respectively.The differences between LAMP and other 2 methods were signifinant(P＜0.01).The difference between the detection rates of AFB and L-J culture was not significant(P＞0.05).With the results of L-J culture as the reference,the sensitivity、specificity、positive and negative predictive values of LAMP were 88.5%(108/122)、82.3%(149/181)、77.1%(108/140)、91.4%(149/163),respectively.The accordance rate of LAMP and L-J culture was 84.8%(257/303). Conclusion LAMP is a rapid,sensitive and specific method for detection of mycobacterium tuberculosis in clinical sputum samples.

Mycobacterium tuberculosis Loop-mediated isothermal amplification Sputum

2012-11-22）

（本文編輯：嚴瑋雯）

310003 杭州市紅十字會醫(yī)院結核病治療中心

王靜，E-mail：wj_wzmc@163.com

[1] Ehsan Aryan,Manoochehr Makvandi,Ahmad Farajzadeh,et al.