王克義 倪海峰 沈俊婭 冷建杭 王建莉

●論 著

鼻咽癌組織中p15INK4b和p27KIP1基因甲基化及其相關(guān)性研究

王克義 倪海峰 沈俊婭 冷建杭 王建莉

目的 探討鼻咽癌組織中p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在鼻咽癌臨床早期診斷和治療中的作用。方法應(yīng)用甲基化特異性PCR方法對65例鼻咽癌組織（鼻咽癌組）和30例正常鼻咽上皮組織（對照組）中的p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測。結(jié)果鼻咽癌組中p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化陽性率分別為26.2%（17/65）和61.5%（40/65），兩者總檢出率為72.3%（47/65）；而對照組中均未檢測到p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化；兩組間p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化陽性率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。鼻咽癌組中p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化與其臨床分期及病理特征均無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。同時(shí)，p15INK4b基因甲基化和p27KIP1基因甲基化間無明顯相關(guān)性（r=-0.03，P＞0.05）。結(jié)論p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化可能參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展；p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化具有一定的腫瘤特異性，有助于鼻咽癌的早期輔助診斷和治療。

鼻咽癌 p15INK4b基因 p27KIP1基因 甲基化

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the promoter methylation status of p15INK4band p27KIP1genes in nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsThe methylation status of p15INK4band p27KIP1genes promoter region were detected by methylation-specific polymerase chain reaction (MSP)in 65 specimens of NPC tissues(NPC group)and 30 specimens of normal nasopharyngeal epithelia tissues(control group).ResultsThe promoter methylation rates of p15INK4band p27KIP1genes were 26.2% (17/65)and 61.5%(40/65),respectively in NPC group,while no methylation of the two genes were detected in control group(P＜0.01).The methylation of p15INK4band p27KIP1genes were not correlated with the clinicopathological characteristics of patients with NPC(P＞0.05).There were no significant correlation between the methylations of p15INK4bgenes and p27KIP1genes(r=-0.03,P＞0.05).ConclusionThe methylation of p15INK4band p27KIP1genes promoter regions may be associated with the development of NPC,which may used as potential markers for early diagnosis of NPC.

鼻咽癌是我國最常見的頭頸部惡性腫瘤，惡性程度較高，且易轉(zhuǎn)移。細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，p15INK4b和p27KIP1基因同屬于細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子家族成員，對細(xì)胞增殖周期起負(fù)調(diào)節(jié)作用。p15INK4b或p27KIP1基因失活，可使細(xì)胞增殖失控向腫瘤性增生轉(zhuǎn)化，而在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)DNA異常甲基化是引起抑癌基因失活的重要機(jī)制之一。鼻咽癌的發(fā)生與多種抑癌基因的DNA甲基化有關(guān)，但對同一腫瘤，同時(shí)檢測p15INK4b和p27KIP1基因甲基化的報(bào)道尚未見。本研究對鼻咽癌組織中的p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，以探討其在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義及其相互關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2009-09—2012-09杭州市第一人民醫(yī)院就診的未經(jīng)放化療的65例鼻咽癌患者的纖維鼻咽鏡活檢標(biāo)本，患者中男43例，女22例，年齡21～72（44.1±9.1）歲。病理診斷（參照1991年WHO分型）：低分化鱗癌56例，未分化癌9例。TNM分期（按照2002年UICC制定標(biāo)準(zhǔn)）：Ⅰ期6例，Ⅱ期20例，Ⅲ期26例，Ⅳ期13例。另擇30例行鼻中隔矯正術(shù)患者的鼻腔后上段近鼻咽部正常上皮組織，患者中男19例，女11例，年齡20～73（45.0±8.5）歲。全部組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。兩組患者性別、年齡的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。另取1名健康青年外周血淋巴細(xì)胞作為陽性對照。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行，所有標(biāo)本在采集前均與患者及志愿者簽定知情同意書。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；甲基化酶試劑盒為新英格蘭BioLabs公司產(chǎn)品；TakaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶、Marker為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，分別從鼻咽癌組織、正常鼻咽上皮組織及外周血淋巴細(xì)胞中提取基因組DNA。用分光光度儀測定OD260、OD280，計(jì)算濃度及OD260/OD280比值，OD260/OD280比值≥1.8的DNA為合格樣本。

1.3.2 外周血DNA的CpG甲基化酶修飾 取1μgDNA、2μl10×反應(yīng)緩沖液 、0.1μl 200×S-腺苷甲硫氨酸、1UCpG甲基化酶，加去離子水至20μl，37℃溫育1h。

1.3.3 DNA亞硫酸氫鹽修飾 將鼻咽癌組織、正常鼻咽上皮組織和外周血淋巴細(xì)胞中提取的DNA及經(jīng)CpG甲基化酶處理的DNA分別作亞硫酸氫鹽修飾，具體操作步驟參照Zhang等[1]報(bào)道的方法進(jìn)行。外周血淋巴細(xì)胞中提取的DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后用于非甲基化陽性對照模板。

1.3.4 甲基化特異性PCR p15INK4b基因甲基化和非甲基化特異性PCR引物序列參照Wong等[2]的報(bào)道，其中p27KIP1基因甲基化特異性 PCR引物序列：上游5′-ATGGAAGAGGCGAGTTAGCGT-3′，下游5′-AACGCCGCCGAACGACTCCCG-3′；p27KIP1基因非甲基化特異性PCR引物序列：上游5′-ATGGAAGAGGTGAGTTAGTG-3′，下游5′-AACACCACCAAACAACTCCCA-3′，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。甲基化特異性PCR程序（片段大小197bp）：95℃預(yù)變性3min，94℃30s、60～65℃20s、72℃20s，共37個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。非甲基化特異性PCR程序（片段大小197bp）：95℃預(yù)變性3min，94℃30s、59～61℃20s、72℃20s，共37個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。2%瓊脂糖凝膠電泳分析。正常外周血淋巴細(xì)胞DNA作為非甲基化陽性對照，CpG甲基化酶修飾后正常外周血淋巴細(xì)胞DNA模板作為甲基化陽性對照，去離子水作為空白對照。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 將僅用甲基化引物擴(kuò)增有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或用甲基化和非甲基化引物擴(kuò)增均有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)本定義為陽性（甲基化）標(biāo)本；僅有非甲基化引物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)本定義為陰性（非甲基化）標(biāo)本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果見圖1。

圖1 p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果（MSP：甲基化特異性PCR方法；M：甲基化特異性PCR；U：非甲基化特異性PCR；T1～4：鼻咽癌組織；N1～4：正常鼻咽上皮組織；PC：陽性對照；H2O：陰性對照；Marker：100～200bp）

鼻咽癌組患者p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化陽性率分別為26.2%（17/65）和61.5%（40/65），兩者總檢出率為72.3%（47/65），而正常對照組均未檢測到p15INK4b和 p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化，兩組患者p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化陽性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系 見表1。

由表1可見，p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化與患者年齡、性別、T分期、N分期、TNM分期、病理類型等臨床特征均無相關(guān)性。

2.3 鼻咽癌患者p15INK4b與p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系 見表2。

由表2可見，65例鼻咽癌組織中同時(shí)出現(xiàn)p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化為10例，同時(shí)出現(xiàn)非甲基化為18例，兩者無明顯相關(guān)關(guān)系（r=-0.03，P＞0.05）。

3 討論

我國鼻咽癌的發(fā)病率居世界首位，南方發(fā)病率高于北方，尤其是廣西、廣東、湖南等省份，發(fā)病率可高達(dá)15/ 10萬～30/10萬。近年來，鼻咽癌在江浙一帶逐漸成為常見的頭頸部惡性腫瘤。由于鼻咽癌的發(fā)生部位隱蔽，早期往往無任何癥狀，大多數(shù)患者初診時(shí)就發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，75%的患者在確診時(shí)已是Ⅲ、Ⅳ期。鼻咽癌的治療效果與臨床分期密切相關(guān)，Ⅰ期患者在放療之后，5年生存率可達(dá)到90%以上，而晚期患者的5年生存率僅8%～10%[3]。因此，研究鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制并且尋找早期診斷及判斷預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物已成為重要的課題。

表1 鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系[例（%）]

表2 鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系（例）

細(xì)胞周期是細(xì)胞重要的生命現(xiàn)象之一，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期的失調(diào)密切相關(guān)。細(xì)胞周期調(diào)控主要通過細(xì)胞周期素（Cyclin）、細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶（CDKs）和細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶抑制蛋白（CDKIs）對G1/S和G2/M關(guān)卡的調(diào)控作用完成。CDKIs在此過程中發(fā)揮了重要的作用，其可分為兩類：INK4/ARF基因家族和CIP/KIP基因家族。INK4/ARF基因是繼p53基因和RB基因等數(shù)十個(gè)抑癌基因之后發(fā)現(xiàn)的專職調(diào)控細(xì)胞周期的抑癌基因[4]，定位于9P21，橫跨大約35kb的范圍，編碼3個(gè)重要的抑癌基因：p15INK4b、p16INK4a和p14ARF，其中p15INK4b基因的cDNA全長837bp，編碼由137個(gè)氨基酸組成的分子量為15kD的蛋白質(zhì)。p15INK4b通過與細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶CDK4/CDK6結(jié)合，從而抑制CDK4和CDK6的活性，促進(jìn)RB基因的產(chǎn)物RB蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄而使細(xì)胞停滯在G1期，從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖。CIP/KIP基因家族包括p27KIP1、p57KIP2和p21CIP1/WAF1/SDI，其中 p27KIP1基因是1994年P(guān)olyak等[5]發(fā)現(xiàn)的一類非常重要的調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的多重腫瘤抑制基因，定位于12P13，cDNA長度為594bp，編碼由198個(gè)氨基酸組成的分子量為27kD的蛋白質(zhì)。正常情況下，p27KIP1在細(xì)胞周期的G0/G1期表達(dá)增高，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)表達(dá)下降。它可以抑制細(xì)胞的DNA合成，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。作為一個(gè)非特異性CDKs抑制因子，p27KIP1能與CyclinDCDK4、CyclinD-CDK6、CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2等復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，使細(xì)胞停滯于G1期。此外，p27KIP1還具有啟動細(xì)胞凋亡的作用。因此，p15INK4b和p27KIP1均具有顯著的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控作用，其失活都將引起細(xì)胞周期G1-S期的重要轉(zhuǎn)換，驅(qū)動細(xì)胞周期的運(yùn)行，使細(xì)胞增殖、分裂過快，從而促使腫瘤形成。

基因突變、缺失和啟動子區(qū)甲基化都是基因失活的機(jī)制，其中基因啟動子區(qū)甲基化可引起與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)的基因表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞惡變，最后形成腫瘤。近年來的研究表明，肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌等都與DNA的甲基化有關(guān)[6]。而據(jù)報(bào)道，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化在腮腺樣囊性癌[7]、肺癌[4]、食管癌[8]和肝癌[9]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目前，關(guān)于鼻咽癌組織中p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化的研究很少，且兩者同時(shí)在鼻咽癌組織中的甲基化狀態(tài)及其相互關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。

董洪松等[10]發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中p15和p27蛋白表達(dá)陽性率分別為65.1%和69.7%，而在非鼻咽癌組織中均100%表達(dá)，并且p15和p27蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與鼻咽癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腦神經(jīng)侵犯及治療后5年生存率無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化均只發(fā)生在鼻咽癌組織中，陽性率分別為26.2%（17/65）和61.5%（40/65），兩者總檢出率為72.3%（47/65），表明p15INK4b和p27KIP1基因甲基化具有一定的腫瘤特異性，而且與董洪松等的研究結(jié)果相似，其甲基化狀態(tài)與臨床分期及病理特征均無相關(guān)性，提示p15INK4b和p27KIP1基因甲基化可能在鼻咽癌早期即發(fā)生，并參與癌變的整個(gè)過程。因此，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化檢測結(jié)果有助于良、惡性鼻咽組織的鑒別，并有望成為鼻咽癌的早期診斷指標(biāo)。本研究結(jié)果也與Kwong等[11]的結(jié)果一致，即鼻咽癌中p15INK4b基因17%的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者臨床特征均無明顯相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化無明顯相關(guān)性，提示這兩個(gè)基因在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中各自發(fā)揮作用，協(xié)同作用并不明顯。

綜上所述，鼻咽癌組織中p15INK4b和p27KIP1基因啟動子區(qū)甲基化與其臨床特征雖無明顯關(guān)系，但該過程可能在鼻咽細(xì)胞的癌變早期即已發(fā)生，并參與鼻咽癌的整個(gè)細(xì)胞增殖過程，在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，故有望成為鼻咽癌的早期診斷指標(biāo)。DNA甲基化是一個(gè)可逆過程，用去甲基化藥物可以逆轉(zhuǎn)腫瘤抑制基因的甲基化失活對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程，逆轉(zhuǎn)甲基化修飾可以重新激活因甲基化失活的腫瘤抑制基因[12]。此外，由于p15INK4b和p27KIP1基因產(chǎn)物具有抑制細(xì)胞惡性增殖的作用，因此用藥物促使這些甲基化的基因重新激活表達(dá)，或可恢復(fù)其抑制鼻咽癌細(xì)胞惡性增殖的能力。因此，去甲基化藥物可能具有潛在的基因治療價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。

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（本文編輯：沈叔洪）

《浙江醫(yī)學(xué)》“病例討論”欄目征稿

根據(jù)廣大讀者的建議，本刊自2010年第7期起開辟“病例討論”欄目，論文結(jié)構(gòu)分為“病例摘要”和“討論”兩部分，以期通過對疑難、復(fù)雜或罕見病例的介紹和討論，交流臨床工作經(jīng)驗(yàn)，幫助廣大臨床醫(yī)師掌握科學(xué)的臨床思維方式，提高各?？坪投鄬W(xué)科的綜合分析判斷能力，進(jìn)而提高醫(yī)療水平?，F(xiàn)特向廣大臨床醫(yī)師征集相關(guān)病例，具體要求如下。

1病例選擇 （1）疑難病例，特別是涉及多學(xué)科、多領(lǐng)域的疑難病例；（2）診斷明確，但病情危重和（或）治療棘手的病例；（3）臨床較罕見的病例。以上病例均需最終獲得明確診斷或成功治療，且臨床資料齊全，并能提供實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)和（或）病理確診依據(jù)。

2寫作格式和要求（1）病歷摘要：分段敘述患者的簡要病史（包括主訴、現(xiàn)病史、既往史等）、入院后體檢情況、輔助檢查結(jié)果、入院后治療方案及病情變化等內(nèi)容；（2）討論：分段記錄各級或各科或各院醫(yī)師對該病例的特點(diǎn)、診斷、鑒別診斷、進(jìn)一步輔助檢查和治療方案等方面的分析，若為罕見病，則需介紹目前國內(nèi)外關(guān)于該病診治方面的最新進(jìn)展；（3）列出相關(guān)的國內(nèi)外主要參考文獻(xiàn)；（4）全文字?jǐn)?shù)在3000字左右。

3投稿注意事項(xiàng) 投稿時(shí)請務(wù)必在稿件末頁留下第一作者手機(jī)號碼和電子郵箱地址，同時(shí)附上單位證明（證明該病例所有資料屬實(shí)，無一稿兩投，無涉及保密等情況）。

本刊編輯部

Promoter methylation status of p15INK4band p27KIP1genes in nasopharyngeal carcinoma

Nasopharyngeal carcinoma p15INK4bp27KIP1Methylation

2013-03-05）

310058杭州，浙江大學(xué)免疫學(xué)研究所（王克義、王建莉，王克義系在職碩士研究生，現(xiàn)在杭州市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室工作）；杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（倪海峰），中心實(shí)驗(yàn)室（沈俊婭、冷建杭）

王建莉，Email:jlwang@zju.edu.cn