裘琳 許泓 張信美

小鼠子宮腺肌病模型病灶中雌孕激素受體的表達(dá)及意義

裘琳 許泓 張信美

目的 探討雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）在子宮腺肌病模型病灶中的表達(dá)及臨床意義。 方法 用異體垂體移植法建立ICR小鼠子宮腺肌病模型，應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜、模型子宮內(nèi)膜及病灶異位子宮內(nèi)膜中ER、PR的表達(dá)。 結(jié)果 垂體移植4個(gè)月和6個(gè)月后，均成功誘發(fā)子宮腺肌病模型，不同時(shí)間誘發(fā)模型的病灶大體結(jié)節(jié)數(shù)和HE染色評(píng)分之間比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0．05）；建模6個(gè)月后模型病灶的結(jié)節(jié)顯著大于建模4個(gè)月后（P＜0．05）。建模后4個(gè)月，模型子宮內(nèi)膜和病灶異位子宮內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜中ER和PR表達(dá)的陽(yáng)性率比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0．05）；建模后6個(gè)月，3種子宮內(nèi)膜中ER陽(yáng)性率分別為55．07%、31．63%和24．74%；PR陽(yáng)性率為48．40%、27．48%和22．70%；3者比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0．05）。 結(jié)論 子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展可能與子宮內(nèi)膜局部ER、PR的高表達(dá)相關(guān)。

子宮腺肌病 ICR小鼠 雌激素受體 孕激素受體 免疫組織化學(xué)

子宮腺肌病是子宮內(nèi)膜組織包括腺體和間質(zhì)在子宮肌層內(nèi)生長(zhǎng)所致的一種激素依賴(lài)性婦科疾病。目前發(fā)病率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但病因及發(fā)病機(jī)制至今仍然不清，且藥物治療效果不佳。近年研究發(fā)現(xiàn)，子宮腺肌病病灶局部激素水平可能與發(fā)病密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)ICR小鼠子宮腺肌病模型[1-2]病灶局部雌激素受體（estrogen receptor,ER）和孕激素受體（progesterone receptor,PR）的表達(dá)，以探討ER、PR在子宮腺肌病發(fā)病中可能的作用及意義，旨在為子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雌性未孕ICR小鼠，鼠齡6～7周，體重（20±2.5）g，由浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。小鼠自由攝食和飲水，光照為亮/暗每12h交替，溫、濕度和通風(fēng)符合浙江大學(xué)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 材料 兔抗鼠多克隆抗體一抗ER（SP1）購(gòu)自Abcam公司；PR（C-19）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二抗購(gòu)自丹麥DAKO公司，DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立及分組 取性成熟未受孕的雌性ICR小鼠20只，隨機(jī)分為4組：A組4只為空白對(duì)照組；B組4只為假手術(shù)組；C組6只為4月模型組；D組6只為6月模型組。A組小鼠不作任何處理，C、D兩組ICR小鼠行右側(cè)子宮內(nèi)腦垂體移植手術(shù)。手術(shù)步驟為：1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，消毒，下腹正中縱行切口2cm，分離出右側(cè)子宮，在距兩子宮連接0.5cm處剪1小口。另取同周齡ICR雄鼠，引頸處死，立即開(kāi)顱取出腦垂體，分成4份，將1份垂體從小切口放入右側(cè)子宮內(nèi)，用眼科鑷將垂體輕輕推向卵巢側(cè)子宮末端，無(wú)需縫合，將子宮放回腹腔后，腹腔內(nèi)放入青霉素溶液0.25ml（1萬(wàn)U/10g），常規(guī)關(guān)腹。B組除不在子宮內(nèi)放入垂體外，其余手術(shù)操作與模型組相同，術(shù)后除C組飼養(yǎng)4個(gè)月外，其余各組均飼養(yǎng)6個(gè)月。各組小鼠于手術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)引頸處死。

1.3.2 模型病灶的病理組織學(xué)檢測(cè) 20倍放大鏡下大體觀察右側(cè)子宮表面突出的腺肌病結(jié)節(jié)，測(cè)量結(jié)節(jié)大小并計(jì)數(shù)數(shù)目。組織學(xué)診斷按HE染色方法進(jìn)行，在100倍光鏡下按子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)侵入子宮肌層的程度進(jìn)行5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)評(píng)分[3]，量化子宮腺肌病的嚴(yán)重程度。具體為：（1）正常子宮為0級(jí)，評(píng)0分；（2）內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞侵入肌肉內(nèi)層為1級(jí)，評(píng)1分；（3）內(nèi)膜間質(zhì)與腺體侵入肌肉內(nèi)層為2級(jí)，評(píng)2分；（4）內(nèi)膜間質(zhì)與腺體侵入內(nèi)外肌層交界處為3級(jí)，評(píng)3分；（5）內(nèi)膜腺體囊性增生且漿膜層下出現(xiàn)結(jié)節(jié)為4級(jí)，評(píng)4分。每例右側(cè)子宮至少取3個(gè)以上橫斷面分級(jí)后取均值，比較各組評(píng)分的差別。

1.3.3 模型病灶ER與PR表達(dá)的檢測(cè) 取自正常子宮內(nèi)膜、模型子宮內(nèi)膜及病灶異位子宮內(nèi)膜組織，常規(guī)石蠟切片，熱修復(fù)抗原，滴加1∶50稀釋兔抗鼠多克隆抗體一抗ER（SP1）和PR（C-19），室溫（約20℃）孵育1h，滴加二抗，室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，400倍光鏡下觀察正常各組ER、PR陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。ER、PR陽(yáng)性均為細(xì)胞核內(nèi)均勻分布的棕褐色或棕褐色顆粒，胞漿不著色。在400倍光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，并計(jì)算平均陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。

2 結(jié)果

2.1 各組病灶大小、數(shù)目與HE染色評(píng)分的關(guān)系 經(jīng)大體觀察結(jié)合組織切片HE染色證實(shí)，在建模后6個(gè)月，A、B組的小鼠均未發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病的形成；C組建模4個(gè)月時(shí)6只小鼠中5只（5/6）誘發(fā)子宮腺肌病形成；建模6個(gè)月后，D組小鼠（6/6）均誘發(fā)子宮腺肌病形成。建模后4個(gè)月與6個(gè)月形成的大體結(jié)節(jié)數(shù)和HE染色評(píng)分均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），但結(jié)節(jié)大小有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見(jiàn)表1及圖1-2。

表1 各組病灶大小、數(shù)目與HE染色評(píng)分的關(guān)系

圖1 垂體移植術(shù)后ICR小鼠模型病灶結(jié)節(jié)大體觀（A：空白對(duì)照組，子宮形態(tài)正常，走形自然，子宮壁光滑；B：假手術(shù)組，子宮略充血，形態(tài)正常，子宮壁較光滑；C：移植術(shù)后4個(gè)月，子宮充血增粗，扭曲變形，見(jiàn)多個(gè)突起的腺肌病結(jié)節(jié)；D：移植術(shù)后6個(gè)月，子宮明顯增粗，明顯扭曲變形，見(jiàn)多個(gè)突起的腺肌病結(jié)節(jié)）

2.2 ER在各組子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) 建模后4、6個(gè)月，模型組子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中ER的表達(dá)明顯升高，與B組正常內(nèi)膜比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；建模后4個(gè)月，病灶異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中ER的表達(dá)較模型子宮內(nèi)膜降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；隨著病程的延長(zhǎng)，建模后6個(gè)月兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而病灶異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中ER的表達(dá)與A、B組的正常內(nèi)膜相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表2及圖3。

圖2 垂體移植術(shù)后ICR小鼠病灶鏡下觀[A：內(nèi)膜腺體和間質(zhì)與肌層分界清晰，內(nèi)膜未侵入肌層，為0級(jí)；B：內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞侵入肌肉內(nèi)層（箭頭所示）為，1級(jí)；C：內(nèi)膜間質(zhì)與腺體侵入肌肉內(nèi)層（箭頭所示），為2級(jí)；D：內(nèi)膜間質(zhì)與腺體侵入內(nèi)外肌層交界處，局部的肌肉內(nèi)層被侵襲破壞（箭頭所示），為3級(jí)；E；內(nèi)膜腺體囊性增生且漿膜層下出現(xiàn)結(jié)節(jié)（箭頭所示），為4級(jí)；HE染色，×100]

2.3 PR在各組子宮內(nèi)膜組織的表達(dá) 建模后4個(gè)月，模型子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中PR的表達(dá)升高，但與B組的正常內(nèi)膜相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），隨著病程的延長(zhǎng)，PR的表達(dá)進(jìn)一步升高，建模6個(gè)月后模型子宮內(nèi)膜PR水平與A、B組的正常內(nèi)膜相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。建模4個(gè)月后，病灶異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中PR的表達(dá)低于模型子宮內(nèi)膜，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），隨著病程的延長(zhǎng)，建模后6個(gè)月，病灶異位內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中PR的表達(dá)明顯低于模型子宮內(nèi)膜，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），病灶異位內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中PR的表達(dá)與A、B組的正常內(nèi)膜相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見(jiàn)表2及圖3。

表2 各組子宮內(nèi)膜中ER、PR表達(dá)的比較（%）

圖3 ICR小鼠子宮內(nèi)膜ER、PR的表達(dá)[A：正常內(nèi)膜ER陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所示）；B：模型內(nèi)膜ER陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所示）；C：異位內(nèi)膜ER陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所示）；D：正常內(nèi)膜PR陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所示）；E：模型內(nèi)膜PR陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所示）；F.異位內(nèi)膜PR陽(yáng)性表達(dá)（箭頭所示）；SP染色，×400]

3 討論

3.1 ICR小鼠子宮腺肌病模型建立的可行性 子宮腺肌病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，建立子宮腺肌病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀欣诹私獍l(fā)病機(jī)制，從而更有效的預(yù)防和治療。目前國(guó)外廣泛應(yīng)用SHN小鼠建立子宮腺肌病動(dòng)物模型，SHN小鼠有自發(fā)子宮腺肌病的特點(diǎn)，但源于日本，價(jià)格昂貴。本研究選擇ICR小鼠經(jīng)垂體移植建立子宮腺肌病模型，病理組織學(xué)證實(shí)，在移植術(shù)后4個(gè)月，83.3%的小鼠可成功建立子宮腺肌病模型；移植術(shù)后6個(gè)月，100%的小鼠均誘發(fā)了子宮腺肌病，類(lèi)似于文獻(xiàn)報(bào)道的SHN及ICR小鼠子宮腺肌病模型[4-5]，而空白對(duì)照組及假手術(shù)組6個(gè)月后均未發(fā)生子宮腺肌病。本研究同時(shí)應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)空白對(duì)照組及假手術(shù)組ICR小鼠的正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中ER、PR的表達(dá)，結(jié)果表明兩者表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步說(shuō)明手術(shù)操作未影響正常子宮內(nèi)膜ER、PR的表達(dá)。建模4個(gè)月和6個(gè)月的小鼠子宮腺肌病模型中病灶結(jié)節(jié)數(shù)、HE評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與造模時(shí)間短、樣本例數(shù)少有關(guān)，需要進(jìn)一步延長(zhǎng)建模時(shí)間并增加例數(shù)以證明。本研究結(jié)果表明：垂體移植術(shù)后4～6個(gè)月，ICR小鼠同樣可成功建立子宮腺肌病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，而且ICR小鼠國(guó)內(nèi)已有，價(jià)格便宜，易于管理，說(shuō)明選擇ICR小鼠應(yīng)用垂體移植術(shù)建立子宮腺肌病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是可行及有效的。

3.2 模型病灶ER和PR在建模中的表達(dá)及作用 臨床資料顯示，月經(jīng)初潮前及青春期子宮腺肌病患者罕見(jiàn)，生育期好發(fā)，妊娠能延緩疾病進(jìn)展，絕經(jīng)后或去卵巢后病情逐漸好轉(zhuǎn)、癥狀消失，說(shuō)明子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展與雌、孕激素密切相關(guān)，當(dāng)激素水平高時(shí)病情進(jìn)展，而低激素狀態(tài)則可抑制疾病的發(fā)展。激素通過(guò)受體發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，雌、孕激素只有與靶器官組織上的相應(yīng)受體特異性結(jié)合，才能發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。在相同激素水平下，在靶細(xì)胞和組織中產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱，取決于受體的含量及進(jìn)入外周循環(huán)的難易度[6]，ER和PR廣泛存在于子宮內(nèi)膜的組織細(xì)胞中，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)和生理周期變化，是局部介導(dǎo)雌、孕激素作用的關(guān)鍵。對(duì)于子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜組織中ER、PR的表達(dá)，有的研究認(rèn)為增高[7]，有的則相反[8]。本研究結(jié)果表明，建模后6個(gè)月，子宮腺肌病模型小鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中ER、PR的表達(dá)明顯高于病灶異位子宮內(nèi)膜及正常內(nèi)膜間質(zhì)及腺體，與文獻(xiàn)[9]相符，提示子宮腺肌病發(fā)病與局部ER、PR的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，ER、PR的表達(dá)增強(qiáng)可能導(dǎo)致雌、孕激素效應(yīng)增強(qiáng)，這種改變減輕了體內(nèi)性激素周期性波動(dòng)對(duì)模型子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響，使內(nèi)膜細(xì)胞持續(xù)低水平增殖，在子宮內(nèi)膜的侵襲過(guò)程中起重要的作用。結(jié)果還表明，建模后4個(gè)月，病灶異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中ER、PR的表達(dá)低于模型子宮內(nèi)膜，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著病程的延長(zhǎng)，建模后6個(gè)月，病灶異位內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中ER、PR的表達(dá)明顯低于模型子宮內(nèi)膜，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[10-12]，表明在子宮腺肌病發(fā)生的過(guò)程中，病灶異位子宮內(nèi)膜中ER、PR的數(shù)量是在逐漸減少的，對(duì)性激素的反應(yīng)能力逐漸下降，激素調(diào)節(jié)作用不如模型子宮內(nèi)膜,這可能與兩者生長(zhǎng)環(huán)境不同有關(guān)，異位病灶局部的內(nèi)分泌環(huán)境改變及細(xì)胞因子作用不同，導(dǎo)致ER、PR的合成過(guò)程存在缺陷。異位內(nèi)膜較低的ER、PR濃度，在一定程度上可能是子宮腺肌病對(duì)內(nèi)分泌治療反應(yīng)較差的原因[13-14]。異位病灶內(nèi)PR的低表達(dá)則表明子宮腺肌病的發(fā)病過(guò)程可能與“孕激素抵抗”有關(guān)[15]。

本研究表明，隨著子宮腺肌病的進(jìn)展，ER、PR在模型子宮內(nèi)膜的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，高于正常內(nèi)膜，說(shuō)明子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展與局部ER、PR高表達(dá)使子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)，而在病灶異位子宮內(nèi)膜中ER、PR的表達(dá)逐漸減少，解釋了子宮腺肌病對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感的原因,但子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，還有待進(jìn)一步深入研究。

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Expression of estrogen receptor and progesterone receptor in mice adenomyosis model

Adenomyosis ICR mice Estrogen receptorProgesterone receptorImmunohistochemistry

2012-10-09）

（本文編輯：胥昀）

浙江省科技廳項(xiàng)目（2006R10027）

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（裘琳）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科（許泓、張信美）

張信美，E-mail：zhangxinmei20071116@yahoo.cn

【 Abstract】Objective To investigate the expression estrogen receptor(ER)and progesterone receptor(PR)in rice adenomyosis model and its significance．Methods The adenomyosis model was induced by allogeneic pituitary transplantation in ICR mice．The expression of ER and PR in endometrial tissue was detected by immunohistochemistry SP method．Results Adenomyosis was induced successfully by allogeneic pituitary transplantation in ICR mice 4 months and 6 months after transplantation．There were no differences in the number of nodules and the grades of H&E staining between 4 and 6 months after transplantation(P＞0．05)．But the size of nodules at 6 months was larger than that at 4 months(P＜0．05)．At 6 months after transplantation, the positive rate of ER and PR in endometrial tissue or ectopic endometrial tissue were higher than that in normal endometrial tissue(P＜0．05);however,the difference was not observed at 4 months after transplantation．Conclusion The expression of ER and PR in endometrial tissue is associated with the development of adenomyosis in ICR mice model．