趙金鋒 李鋼 王凱誠 陳海平

β-arrestin基因表達對大鼠實驗性急性胰腺炎重癥化進程的影響

趙金鋒 李鋼 王凱誠 陳海平

目的 探討急性胰腺炎重癥化進程與β-arrestin基因抑制Toll樣受體-白介素1受體（TLR-IL-1R）系統(tǒng)作用的相關(guān)性。 方法 建立SD大鼠實驗性急性胰腺炎模型，分為假手術(shù)組（SO）、實驗組（SAP）；以real-time PCR檢測脾臟組織中β-arrestin mRNA的表達，Western blot和免疫組化檢測肝臟組織TRAF6蛋白和胰腺組織中NF-κBp65蛋白表達。 結(jié)果 與SO組比較，SAP組β-arrestin mRNA表達受到顯著抑制；TRAF6蛋白表達下降；NF-κBp65轉(zhuǎn)錄活性增強（P＜0．05或0．01）。 結(jié)論TLR-IL-1R系統(tǒng)可能參與急性胰腺炎重癥化的病理過程。

急性胰腺炎 TLR-IL-1R β-arrestin

急性胰腺炎是臨床常見急癥，其預(yù)后與是否重癥化相關(guān)，目前急性胰腺炎重癥化的機制尚不清楚，但臨床證據(jù)表明與失控的炎癥反應(yīng)相關(guān)。Toll樣受體-白介素1受體（Toll-like receptor-IL-1 receptor，TLR-IL-1R）系統(tǒng)是天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵信號通路，β-arrestin則是TLR-IL-1R系統(tǒng)的負調(diào)控因子。本研究試圖探討急性胰腺炎重癥化進程與β-arrestin基因抑制TLR-IL-1R系統(tǒng)作用的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠41只，雌、雄各半，體重（210± 10）g，購自浙江省實驗動物中心（合格證號：SCXK＜浙＞2003-0001）。?；悄懰徕c購自Sigma公司，RNA提取試劑盒（Trizol Reagent）為北京康為世紀生物科技有限責任公司產(chǎn)品，熒光-PCR試劑盒購于TaKaRa公司，βarrestin引物由北京康為世紀生物科技有限責任公司合成和提供，NF-κBp65親和純化兔多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，二步法免疫組化生物檢測試劑盒（羊抗兔IgG二抗為丹麥DAKO公司產(chǎn)品），TRAF-6（D-10）一抗購于SANTA CRUZ公司、二抗購于北京中杉公司，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配制試劑盒是碧云天產(chǎn)品，小牛血清白蛋白購于BBI公司，聚偏氟乙烯膜為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 實驗分組和動物模型建立 實驗動物按雌雄各半，隨機分為假手術(shù)組（sham operation，SO）10只；實驗組（severe acute pancreatitis,SAP）31只，制作急性胰腺炎模型。術(shù)前禁食12h，自由飲水，2.5%戊巴比妥鈉（2ml/kg）腹腔注射麻醉；備皮、常規(guī)皮膚消毒、鋪巾；由白線進腹。SAP組大鼠胰膽管逆向注射5%?；悄懰徕c1ml/kg、速度0.2ml/min，注射畢停留4min后關(guān)腹；SO組僅模擬上腹部器官翻動[1]，實驗終點為造模后24h，各組在實驗終點采集標本。大鼠稱重后，心臟采血，4℃下3 000r/min離心10min分離血清，置于滅菌試管中-20℃冰箱保存待測。分別取肝臟組織和脾臟組織約200mg，4℃下0.9%氯化鈉溶液漂洗3次，濾紙吸干，-70℃凍存。胰腺組織以4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、包理、切片并HE染色。

1.3 檢測方法 以real-time PCR檢測脾組織中β-ar restin mRNA的表達[2]；Western blot檢測肝臟組織中TNF受體相關(guān)因子 6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）蛋白水平[3]；二步法免疫組化檢測胰腺組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）p65蛋白表達[4]。

1.3.1 脾臟組織β-arrestin mRNA測定 脾臟組織總RNA提取按RNA試劑盒操作要求執(zhí)行。各組抽樣檢測RNA純度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃冰箱中保存。靶基因β-arrestin mRNA引物序列：上游：5′-ATTTGCCTTGCTCCGTCACAC-3′；下游：5′-GGCTCGAATCTCAAAGTCTACTCCA-3′；內(nèi)參三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物序列：上游：5′-AGAC-AGCCGCATCTTCTTGT-3′；下游：5′-CTTGCCGTG-GGTAGAGTCAT-3′。real-time PCR按試劑盒要求執(zhí)行操作。循環(huán)條件：二步法，共40個循環(huán)，記錄平均Ct值。結(jié)果處理按照2-ΔΔCT法：首先計算出每個標本的β-arrestin及內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，ΔCT=Ct（β-arrestin）-Ct（GAPDH），再按照ΔΔCT=ΔCT（SAP組）-ΔCT（SO組）算出β-arrestin在SAP組與SO組之間表達的差異。

1.3.2 肝臟組織TRAF6測定 將肝臟組織粉碎、裂解后提取蛋白，嚴格按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配膠，蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜，分次加一抗、二抗，置于BIO-RAD顯影成像分析系統(tǒng)中顯影成像。

1.3.3 胰腺組織NF-κBp65蛋白的表達 按試劑盒要求執(zhí)行操作，切片厚度3～4μm。陽性判斷：NF-κBp65陽性表現(xiàn)為胰腺腺上皮、導(dǎo)管上皮及胰島部分細胞的胞漿和/或胞核呈棕黃色顆粒。結(jié)果評定標準：根據(jù)著色強度及著色細胞陽性范圍進行計算。著色強度按未著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別記分為0、1、2、3分。著色細胞陽性范圍：計數(shù)4個高倍視野，計算陽性細胞的比例；按0%、1%～29%、30～69%、70～100%分別記分0、1、2、3分。將每張切片著色強度與著色細胞陽性范圍得分相加為其最后積分。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示。組間均值比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 SAP組大鼠造模后不覓食，畏寒，皮毛疏松，腹部膨隆，而SO組大鼠無異常發(fā)現(xiàn)。實驗終點SAP組存活10只，死亡率67.7%，死亡高峰出現(xiàn)在12h前后。SO組無死亡，兩組間比較存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

2.2 病理學檢查 大體觀SAP組大鼠膠內(nèi)有大量腹水腸管擴張，網(wǎng)膜組織和腎脂肪囊可見皂化斑，大鼠胰腺出現(xiàn)水腫、出血、壞死和皂化斑等，與臨床上急性出血壞死性胰腺炎的表現(xiàn)相符。鏡下觀SAP組胰腺邊界不清，小葉結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)水腫明顯，腺泡細胞水腫，呈島狀漂浮，腺腔擴張，胰腺組織廣泛出血，大量中性粒細胞浸潤，大片狀腺體壞死及明顯脂肪壞死和鈣鹽沉積。SO組大鼠無異常病理變化。

2.3 脾臟組織β-arrestin mRNA的表達 SAP組βarrestin mRNA表達受到抑制，與SO組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），見表1、圖1-2。

圖1 SAP組大鼠脾組織中β-arrestin mRNA的表達

圖2 SO組大鼠脾組織中β-arrestin mRNA的表達

2.4 肝臟組織TRAF6蛋白表達 實驗終點時SAP組TRAF6蛋白表達較SO組降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表1、圖3。

圖3 TRAF6蛋白表達（A：SAP組TRAF6蛋白條帶，1-10分別為SAP組大鼠編號；B：SO組TRAF6蛋白條帶，1-10分別為SO組大鼠編號；C：內(nèi)參β-actin條帶）

2.5 胰腺組織NF-κBp65蛋白表達 實驗終點時SAP組NF-κBp65蛋白表達升高，與SO組相比具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表1、圖4。

表1 不同組別大鼠各指標的表達

圖4 SAP組大鼠胰腺NF-κBp65蛋白高表達（免疫組化二步法，×400）

3 討論

臨床上一些患者的急性胰腺炎會重癥化，而其中部分患者重癥化的進程迅速，病情呈爆發(fā)性發(fā)展，十分兇險，病死率極高，確切的原因和機制尚不清楚[5]，但有證據(jù)表明急性胰腺炎重癥化與機體自身失控的炎癥反應(yīng)有關(guān)。TLR和IL-1R構(gòu)成的TLR-IL-1R系統(tǒng)是炎癥時機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號系統(tǒng)。NF-κB信號通路則參與機體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡的基因表達的調(diào)控。TRAF6通過TLR-IL-1R系統(tǒng)調(diào)控NF-κB的活性。存在于細胞質(zhì)中的β-arrestin在進化上非常保守，是TLR-IL-1R信號系統(tǒng)的負調(diào)控因子。βarrestin對不同的TLR無特異性，通過與TRAF6相互作用抑制TLR-IL-1R信號通路的傳導(dǎo)。與大多數(shù)調(diào)控分子不同，β-arrestin的表達不受TLR信號的調(diào)控，但是β-arrestin與TRAF6之間相互作用卻受到了TLR信號調(diào)控，β-arrestin與TRAF6之間的結(jié)合依賴于TLR-IL-1R信號通路的活化，因而β-arrestin與TRAF6之間的相互作用決定了β-arrestin對TLR-IL-1R信號通路的抑制作用[6-7]。這種調(diào)控一方面保證了有足夠的天然免疫和炎癥反應(yīng)；另一方面也使機體避免了過度的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。

本研究中，在實驗性急性胰腺炎的一定時相，SAP組大鼠大量死亡，這一時相相當于臨床上SAP的重癥化時期。同時Western blot檢測提示TRAF6蛋白含量下降，提示TRAF6被泛素化修飾后，又被蛋白酶復(fù)合體降解；同步出現(xiàn)TLR-IL-1R信號通路的抑制因子β-arrestin基因表達的明顯抑制，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增強。實驗證明，在迅速放大的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機體自我損傷，病情呈重癥化發(fā)展的過程中，TLR-IL-1R信號系統(tǒng)作用強化。提示TLR-IL-1R信號系統(tǒng)參與急性胰腺炎重癥化進程；在此進程中該信號系統(tǒng)的負調(diào)控因子βarrestin的基因表達受到明顯抑制。

當機體面對嚴重的炎癥性疾病如SAP時，限制TLR信號系統(tǒng)對于控制炎癥反應(yīng)的強度和持續(xù)的時間是十分重要的。在發(fā)病的早期，多樣性/內(nèi)源性TLR配體激活TLR信號，導(dǎo)致多種炎性細胞因子表達，如TNF-α和IL-6等，這些細胞因子本身也可以引起免疫應(yīng)答，導(dǎo)致更多的細胞因子活化，使得炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大。本研究結(jié)果提示β-arrestin通過其與TLR-IL-1R信號系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子TRAF6相互作用，抑制這種級聯(lián)放大效應(yīng)，把炎癥反應(yīng)控制在一定的程度，為阻止急性胰腺炎重癥化的發(fā)展提供一定的治療靶點。

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Expression of β-arrestin gene in rats with experimental severe acute pancreatitis

Acute pancreatitis TLR-IL-1R β-arrestin

2012-04-25）

（本文編輯：胥昀）

杭州市科技發(fā)展計劃醫(yī)學重點?？茖２№椖浚?0070433 Q22）

310007 杭州，浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院（杭州市中醫(yī)院）外一科

李鋼，E-mail:ligang20030330@163.com

【 Abstract】Objective To investigate the expression of β-arrestin gene in rats with severe acute pancreatitis．Methods Experimental severe acute pancreatitis(SAP)was induced in SD rats．The expression of β-arrestin mRNA in splenic tissue was detected by real-time RT-PCR,the TRAF6 protein in liver tissue and NF-κBp65 protein in pancreatic tissue were assessed by Western blot and immunohistochemistry respectively．Results The expression of β-arrestin mRNA in splenic tissue was significantly inhibited;the expression of TRAF6 protein in liver tissue was decreased;and the transcriptional activity of NF-κB was increased in SAP rats．Conclusion Results indicate that the TLR-IL-1R signaling system may be involved in the pathological process of severe acute pancreatitis．