朱少明 龔婷婷 吳鋒 朱彪

拉米夫定治療慢性乙型肝炎YMDD變異的相關(guān)因素分析

朱少明 龔婷婷 吳鋒 朱彪

目的 分析拉米夫定治療后慢性乙型肝炎酪氨酸（Y）、蛋氨酸（M）、天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）變異的相關(guān)因素。方法 對169例經(jīng)拉米夫定治療12個月后的慢性乙型肝炎患者發(fā)生YMDD變異情況進行回顧性分析。采用熒光定量PCR和PCR產(chǎn)物測序等方法檢測慢性乙型肝炎拉米夫定治療前、治療后HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg狀態(tài)、ALT水平等指標(biāo)。 結(jié)果 在169例患者中，基因型B共76例（44．97%）,基因型C共93例（55．03%）。拉米夫定治療12個月后，46例（27．22%）患者發(fā)生YMDD變異，其中，基因型B變異27例（35．53%），基因型C變異19例（20．43%），兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。YMDD變異組患者治療前HBV DNA水平顯著高于YMDD未變異組[（7．26±0．58 vs6．44±0．65）log拷貝/ml，P＜0．05]。HBeAg陽性患者YMDD變異率顯著高于HBeAg陰性患者（38．10%vs20．75%，P＜0．05）。YMDD變異組與未變異組在治療前ALT水平上無明顯差異[（136．09±28．21 vs 124．15±26．52）U/L，P＞0．05]。 結(jié)論 拉米夫定治療慢性乙型肝炎發(fā)生YMDD變異與HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg狀態(tài)等密切相關(guān)。拉米夫定治療前，檢測HBV基因型、HBV DNA水平，HBeAg狀態(tài)等指標(biāo)對慢性乙型肝炎抗病毒治療具有重要意義。

慢性乙型肝炎 拉米夫定 YMDD變異 相關(guān)因素 基因型

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌的最主要因素，拉米夫定是目前治療慢性乙型肝炎的主要藥物之一。然而，由于HBV發(fā)生酪氨酸（Y）、蛋氨酸（M）、天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）變異（即YMDD變異）可出現(xiàn)拉米夫定耐藥，主要表現(xiàn)為患者HBV DNA陽轉(zhuǎn)，ALT升高[1]，甚至出現(xiàn)病情加重和惡化[2]。本研究對169例慢性乙型肝炎患者經(jīng)拉米夫定治療12個月后發(fā)生YMDD變異情況進行回顧性分析，探討拉米夫定治療前HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg狀態(tài)、ALT水平與YMDD變異的相關(guān)性，為臨床抗病毒治療提供幫助。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2007-08—2010-11在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院門診或住院的慢性乙型肝炎患者共169 例，診斷均符合病毒性肝炎防治方案[3]。其中男95例，平均年齡48歲；女74例，平均年齡43歲。全部患者僅接受拉米夫定治療，治療周期1～3年。在拉米夫定治療前檢測ALT、HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg狀態(tài)、YMDD變異等指標(biāo)；治療后每隔3個月定期復(fù)查以上指標(biāo)。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學(xué)指標(biāo) 乙型肝炎病毒指標(biāo)采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，肝功能指標(biāo)采用日立生化全自動分析儀測定。HBV DNA水平采用熒光定量PCR法在標(biāo)準(zhǔn)PCR實驗室測定。

1.2.2 HBV基因型分析 HBV基因型采用酶聯(lián)免疫吸附法測定[4]。按照HBV基因型試劑盒（日本東京免疫研究所）說明書進行操作，該試劑盒采用乙型肝炎病毒前S2抗原（PreS2抗原）的單克隆抗體（m、k、s和u）作為一抗研制而成。實驗結(jié)果判斷依據(jù)：m陽性提示基因型B，k和s陽性提示基因型C。

1.2.3 HBV YMDD變異分析 采用PCR產(chǎn)物測序的方法檢測HBV YMDD變異。主要實驗步驟包括：（1）HBV DNA聚合酶基因PCR擴增：擴增片段長度589 bp，反應(yīng)參數(shù)：94℃ 2min，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 45s，35個循環(huán)；72℃10min；4℃終止。（2）PCR產(chǎn)物測序：按試劑盒說明書進行操作，在MagaBACE 500測序儀上測定PCR產(chǎn)物序列。所獲得核酸序列與標(biāo)準(zhǔn)HBV比對，進行HBV的YMDD變異分析，具體參見文獻(xiàn)[5]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間差異比較采用t檢驗；組間率比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HBV基因型與YMDD變異的關(guān)系 169例患者中，76例（44.97%）為HBV基因型B，93例（55.03%）為HBV基因型C，未發(fā)現(xiàn)其他基因型。拉米夫定治療前，B、C基因型患者在性別、年齡、ALT等方面無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。經(jīng)過拉米夫定治療12個月后，共46例（27.22%）發(fā)生YMDD變異。B基因型中，發(fā)生YMDD變異有27例（35.53%），C基因型中有19例（20.43%），兩組變異率比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。YMDD變異組與未變異組患者治療前在年齡、性別等方面無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表1 拉米夫定治療前不同基因型患者臨床資料比較

2.2HBV DNA水平與YMDD變異的關(guān)系 46例YMDD變異慢性乙型肝炎患者治療前HBV DNA水平均值為（7.26±0.58）log拷貝/ml，123例未變異患者治療前HBV DNA水平均值為（6.44±0.65）log拷貝/ml，兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見表2。

2.3 HBeAg狀態(tài)與YMDD變異的關(guān)系 169例患者中，63例HBeAg陽性，106例HBeAg陰性。在HBeAg陽性患者中，發(fā)生YMDD變異24例（38.10%）；而HBeAg陰性患者中，發(fā)生YMDD變異22例（20.75%），兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見表2。

2.4 ALT與YMDD變異的關(guān)系 46例YMDD變異患者治療前ALT均值為（136.09±28.21）U/L，123例未變異患者治療前ALT均值為（124.15±26.52）U/L，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2 YMDD變異組與未變異組患者拉米夫定治療前臨床特征比較

3 討論

長期服用拉米夫定，可以導(dǎo)致慢性乙型肝炎出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，已經(jīng)證實拉米夫定耐藥與HBV聚合酶YMDD變異密切相關(guān)，即YMDD基序中的蛋氨酸（M）被異亮氨酸（I）或纈氨酸（V）所取代?，F(xiàn)有研究報道：1、2、3年拉米夫定治療后，YMDD變異率分別為14%、38%、49%[1，6]。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)過12個月拉米夫定治療后YMDD變異率為27.22%，高于其他學(xué)者的研究報道[6]。然而，日本學(xué)者報道[7]：經(jīng)過1年的拉米夫定治療，日本慢性乙型肝炎的YMDD變異率高達(dá)57.4%。因此，進行拉米夫定治療所導(dǎo)致的YMDD變異因素的分析，對核苷類藥物抗病毒治療方案的療效與預(yù)后判斷等具有重要意義。

HBV基因型具有地域分布差異性的特點，并且與慢性乙型肝炎疾病進展、抗病毒藥物療效及預(yù)后等因素密切相關(guān)。HBV基因型A、D主要分布于歐洲及非洲，基因型B、C主要分布于遠(yuǎn)東東部、亞洲等。本研究結(jié)果顯示慢性乙型肝炎HBV基因型主要為C型和B型，經(jīng)過拉米夫定治療12個月后，基因型B慢性乙型肝炎發(fā)生YMDD變異率為35.53%，基因型C YMDD變異率為20.43%,表明基因型B的慢性乙型肝炎更容易發(fā)生YMDD變異。該研究結(jié)果與此前臺灣學(xué)者的研究結(jié)果不一致，后者認(rèn)為C基因型的YMDD變異率高于B基因型[8]。這可能與不同地區(qū)慢性乙型肝炎HBV基因型特點不一致相關(guān)。因此，在拉米夫定治療前，對慢性乙型肝炎進行HBV基因型檢測，將有助于判斷患者出現(xiàn)拉米夫定耐藥的可能性。

目前已有研究認(rèn)為：YMDD變異與病毒因素、病毒和宿主相互作用密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示：YMDD變異組患者治療前HBV DNA水平顯著高于未發(fā)生YMDD變異組，即在拉米夫定治療前，HBVDNA水平越高，YMDD變異出現(xiàn)的概率越高。這與Chang等[9]研究報道：HBV DNA水平與YMDD變異成正相關(guān)相一致。HBeAg陽性的慢性乙型肝炎YMDD變異率顯著高于HBeAg陰性患者的YMDD變異率，提示治療前HBeAg陽性的慢性乙型肝炎更容易發(fā)生YMDD變異。YMDD變異患者與未變異患者治療前的ALT水平無統(tǒng)計學(xué)差異，說明在拉米夫定治療前，慢性乙型肝炎的ALT水平與治療后YMDD變異沒有明顯的相關(guān)性。但是，ALT作為一個非常重要的反映患者肝功能的指標(biāo)，在拉米夫定治療前、后必須及時動態(tài)監(jiān)測。

總之，本研究提示拉米夫定治療前慢性乙型肝炎患者的HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg狀態(tài)與治療后發(fā)生YMDD變異密切相關(guān)，其中基因型B、治療前HBV DNA水平高、HBeAg陽性的慢性乙型肝炎更容易發(fā)生YMDD變異。因此，拉米夫定治療前，檢測HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg狀態(tài)等指標(biāo)對慢性乙型肝炎抗病毒治療具有重要指導(dǎo)意義。

[1]Leung N W,Lai C L,Chang T T,et al．Extended lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B enhances hepatitis B e antigen seroconversion rates:results after 3 years of therapy [J]．Hepatology,2001,33(6):1527-1532．

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[3]中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會．慢性乙型肝炎防治方案[J]．中華傳染病雜志,2005,23(6):421-431．

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[8]Kao J H,Liu C J,Chen D S．Hepatitis B viral genotypes and lamivudine resistance[J]．J Hepatol,2002,36(2):303-304．

[9]Chang M L,Chien R N,Yeh C T,et al．Virus and transaminase levels determine the emergence of drug resistance during long-term lamivudine therapy in chronic hepatitis B[J]．J Hepatol,2005,43(1):72-77．

Factors related to HBV YMDD mutations in chronic hepatitis B patients during lamivudine treatment

Chronic hepatitis B Lamivudine YMDD mutations Relative factors Genotypes

2012-10-26）

（本文編輯：胥昀）

310003 杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院超聲科（朱少明、龔婷婷），藥劑科（吳鋒），感染科（朱彪）

【 Abstract】Objective To investigate the factors related to HBV YMDD mutations in chronic hepatitis B patients during lamivudine therapy．Methods One hundred and sixty-nine chronic hepatitis B patients receiving lamivudine therapy for more than one year were retrospectively enrolled in the study．HBV genotypes,HBV DNA load,HBeAg status,and ALT levels were monitored prior to lamivudine treatment and at every three months during one year of lamivudine therapy．Results Of 169 patients,76 (44．97%)were infected with genotype B and 93 patients(55．03%)with genotype C．Total 46 patients(27．22%)with YMDD mutants were detected after one year of lamivudine therapy;there were significant differences in the rate of YMDD mutations between patients with genotypes B and C (35．53%vs 20．43%,P＜0．05)．The HBV DNA levels before treatment in patients with YMDD mutants were significantly higher than those in patients without YMDD mutants (7．26±0．58 vs 6．44±0．65 log copies/ml,P＜0．05)．Significant difference in the rate of YMDD mutations was observed between the patients with positive HBeAg and patients with negative HBeAg (38．10%vs 20．75%,P＜0．05)．No significant difference in the ALT levels were observed between the patients with YMDD mutants and without YMDD mutants(136．09±28．21 vs 124．15±26．52 U/L,P＞0．05)． Conclusion HBV genotypes,HBV DNA levels,and HBeAg status are strongly correlated with the emergence of YMDD mutations in chronic hepatitis B patients during lamivudine therapy．