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        清熱安宮丸等中成藥微生物限度檢查方法驗(yàn)證

        2013-04-17 08:47:18
        中國藥業(yè) 2013年24期
        關(guān)鍵詞:試液限度枯草

        黃 英

        (云南省麗江市食品藥品檢驗(yàn)所,云南 麗江 674100)

        根據(jù)2010年版《中國藥典(一部)》規(guī)定,在進(jìn)行藥品微生物限度檢查時,應(yīng)對所用方法進(jìn)行驗(yàn)證,以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查[1]。有些中成藥含有較強(qiáng)的抑菌成分,由于抑菌成分的干擾,采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查,其結(jié)果不能真實(shí)反映其污染的微生物狀況。為使檢測結(jié)果科學(xué)、準(zhǔn)確,檢測前應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。筆者對清熱安宮丸等中成藥進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn),現(xiàn)報道如下。

        1 試驗(yàn)材料

        1.1 菌種

        枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003],均由云南省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

        1.2 培養(yǎng)基

        營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂,MUG、麥康凱瓊脂、膽鹽乳糖、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基為北京三藥科技開發(fā)公司和北京牛?;蚣夹g(shù)有限公司產(chǎn)品,按規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查均為合格。稀釋劑為pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

        1.3 樣品

        婦康寧片(江西華太藥業(yè)有限公司,0.25 g/片),復(fù)方川貝精片(廣東一力集團(tuán)制藥有限公司,100片/瓶),歸脾丸(云南省騰沖制藥廠,9 g/丸),舒肝益脾顆粒(重慶陪都藥業(yè)股份有限公司,10 g/袋),補(bǔ)腎寧片(山東希力藥業(yè)有限公司,0.2 g/片),荊防顆粒(昆明中藥廠有限公司,15 g/袋),抗宮炎膠囊(江西心正藥業(yè)有限責(zé)任公司,0.5 g/粒),寧心安神膠囊(西安方興制藥有限公司,0.5 g/粒),抗病毒片(天津金世制藥有限公司,0.32 g/片),消咳喘片(哈藥集團(tuán)三精黑河藥業(yè)有限公司,0.3 g/片),藿香正氣滴丸(天津天士力制藥股份有限公司,2.6 g/袋),消栓顆粒(黑龍江省濟(jì)仁藥業(yè)有限公司,4 g/袋),清熱安宮丸(江西國藥有限責(zé)任公司,3.5 g/丸)。

        2 方法與結(jié)果[1]

        2.1 菌液制備

        取經(jīng)30~35℃培養(yǎng)18~24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-7~10-5,使成50~100 cfu/mL,經(jīng)活菌計數(shù)后備用。

        取經(jīng)23~28℃ 培養(yǎng)24~48 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-6~10-5,使成50~100 cfu/mL,經(jīng)活菌計數(shù)后備用。

        取經(jīng)23~28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物,用5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子,吸出孢子懸液1 mL至無菌試管內(nèi),用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)50~100 cfu的孢子懸液。

        2.2 供試液制備

        稱取樣品10 g,加pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL,制成1∶10均勻的供試液。

        2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)

        2.3.1 平皿菌落計數(shù)法(常規(guī)法)

        取1∶10供試液1 mL入皿,然后每皿加營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15~20 mL,搖勻,按2010年版《中國藥典(一部)》附錄微生物限度檢驗(yàn)方法進(jìn)行,計算3次試驗(yàn)的平均回收率。結(jié)果見表1。結(jié)果表明,婦康寧片、復(fù)方川貝精片、歸脾丸、舒肝益脾顆粒、補(bǔ)腎寧片、荊防顆粒6個品種對5株試驗(yàn)菌無抑菌作用,回收率均高于70%,可用常規(guī)法檢查。其他品種對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有不同程度的抑菌作用,需改用培養(yǎng)基稀釋法或離心薄膜過濾法重新驗(yàn)證。另外,各品種對大腸埃希菌、白色念珠菌及黑曲霉無抑菌作用,回收率均高于70%,因此霉菌和酵母菌數(shù)計數(shù),均可用常規(guī)法檢查。

        2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法

        取1∶10供試液1 mL,注入5個平皿中(每平皿0.2 mL),然后每皿加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20 mL,搖勻,按2010年版《中國藥典(一部)》附錄微生物限度檢驗(yàn)方法進(jìn)行,計算3次試驗(yàn)的平均回收率。結(jié)果見表2??梢?,抗宮炎膠囊、寧心安神膠囊、抗病毒片、消咳喘片4個品種采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿)法,對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均大于70%。

        表1 清熱安宮丸等中成藥常規(guī)法(1 mL/皿)各試驗(yàn)菌回收率(%)

        表2 培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)和離心沉淀法+薄膜過濾法回收率(%)

        2.3.3 離心沉淀法+薄膜過濾法

        取1∶10供試液10 mL,移至滅菌離心管中,用500 r/min離心3 min,取上層液1 mL加入100 mL稀釋液(pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)中,經(jīng)減壓抽濾干凈后,用pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗,每次約100 mL,共沖洗400 mL/膜,在最后一次沖洗液中加入菌懸液1 mL(50~100 cfu/mL)。濾干后取膜,菌面向上貼于營養(yǎng)瓊脂平板,經(jīng)35℃培養(yǎng)3 d后,點(diǎn)計菌落數(shù)。計算3次試驗(yàn)的平均回收率,結(jié)果見表2。可見,藿香正氣滴丸、消栓顆粒、清熱安宮丸3個品種采用離心薄膜過濾法,對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均大于70%。

        2.4 控制菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

        試驗(yàn)組:取規(guī)定量供試液及10~100 cfu試驗(yàn)菌株,加入相應(yīng)規(guī)定量的培養(yǎng)基中,按各控制菌檢查法檢查。

        樣品組:取規(guī)定量供試液,加入相應(yīng)規(guī)定量的培養(yǎng)基中,按各控制菌檢查法檢查。

        控制菌檢查結(jié)果:試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌,樣品組未檢出控制菌。各必檢控制菌均可用常規(guī)法檢查。

        3 討論

        中成藥中往往含有多種具有抑菌活性的中藥材,其抑菌作用是幾種藥材抑菌作用的共同體現(xiàn)。寧心安神膠囊處方中含有抑菌成分(丹參、黃連)、抗病毒片處方中含有抑菌成分(連翹、廣藿香)、消栓顆粒處方中含有抑菌成分(黃芪)、清熱安宮丸處方中含有多種抑菌成分(大黃、黃芩、黃柏、梔子、黃連、冰片)等。據(jù)文獻(xiàn)報道[2-4],上述處方中的黃芩、黃柏、黃連、梔子、連翹、冰片、黃芪、丹參、大黃等多味中藥均對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等有抗菌作用,所以對5株代表菌中的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌較敏感,說明抑菌作用的強(qiáng)弱,與處方中所含的抑菌成分的種類、數(shù)量及處方中藥物間的相互作用有關(guān)。由于抑菌成分的影響,可能阻止某些敏感細(xì)菌的生長繁殖,不能真實(shí)地反映藥品污染菌的程度。因此需要針對每個品種進(jìn)行方法驗(yàn)證以確定檢驗(yàn)方法的可行性,根據(jù)藥品抑菌作用的強(qiáng)弱,選擇合適的方法進(jìn)行微生物限度檢查。

        [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄79-附錄88.

        [2]特玉香,劉 鵬,戴 翠,等.黃連上清丸微生物限度檢查方法驗(yàn)證淺析[J].藥物分析雜志,2006,26(11):1 674-1 677.

        [3]宋 勤,杜平華.中成藥微生物限度檢查方法的探討[J].中國藥事,2006,20(1):46-47.

        [4]于風(fēng)平,楊美琴,特玉香,等.含大黃、黃芩、黃連和黃柏藥材的中成藥微生物限度檢查法的建立[J].藥物分析雜志,2010,30(3):558-562.

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