盧金鳳，蒲旭峰

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610072;2．四川省成都市藥品檢驗(yàn)所，四川 成都 610045)

復(fù)方鼻炎寧滴鼻劑由辛夷、甘草等組方，具有通鼻竅、清肝潤(rùn)肺、解毒宣肺、發(fā)散風(fēng)寒的功效，主要用于急性鼻炎和慢性鼻炎急性發(fā)作。辛夷為木蘭科植物望春花、玉蘭或武當(dāng)玉蘭的干燥花蕾[1]，活性成分木蘭脂素[2]有抗炎[3]、鎮(zhèn)痛、抗過(guò)敏反應(yīng)[4]及抗血小板活性因子的活性作用[5]。甘草為豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖，三萜皂苷(甘草酸)和黃酮類是其主要活性成分[6]。甘草酸主要有抗菌、抗病毒[7]、抗炎[8]、抗變態(tài)反應(yīng)作用，并能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能和細(xì)胞免疫功能[9]，因此，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定制劑中甘草酸、木蘭脂素含量，可作為復(fù)方鼻炎寧滴鼻劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT型液相色譜儀;SPD-10A型UV檢測(cè)器;Shimadzu Lcsolution色譜工作站;超聲波處理器。甘草酸單銨鹽對(duì)照品(批號(hào)為110723-200609，供含量檢測(cè)用)，木蘭脂素對(duì)照品(批號(hào)為110801-200724，供含量檢測(cè)用)，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;乙腈、四氫呋喃為色譜純，水為高純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 甘草酸

2．1．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Inertsil ODS-3 柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 -0．01 mol/L 磷酸(36∶64);流速:1．0 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):252 nm;進(jìn)樣量:10 μL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液均有相應(yīng)的峰出現(xiàn)，在甘草酸相應(yīng)的保留時(shí)間處陰性對(duì)照品溶液無(wú)吸收峰，處方中的其他成分不影響甘草酸的含量測(cè)定(見(jiàn)圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

2．1．2 溶液制備

取甘草酸單銨鹽對(duì)照品10 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(每1 mL含甘草酸單銨鹽對(duì)照品0．2 mg，折合甘草酸為0．195 9 mg)。取本品2 mL，加甲醇約45 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例根據(jù)本品制備工藝，制備不含甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備成陰性對(duì)照品溶液。

2．1．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取甘草酸單銨鹽對(duì)照品8．66 mg，置25 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，放冷后加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。用甲醇分別稀釋至質(zhì)量濃度為83．136，166．272，249．408，332．544，415．68 μg/mL。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程 Y=548 141 X ＋52 851，r=0．999 1(n=5)。結(jié)果表明，甘草酸單銨鹽質(zhì)量濃度在83．136～415．68 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果甘草酸峰面積的 RSD為0．74%，表明方法精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同批樣品，按供試品溶液制備方法制備6份溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果甘草酸含量的 RSD為0．26%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h時(shí)進(jìn)樣10 μL。結(jié)果甘草酸峰面積的 RSD為0．24%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密量取2 mL已知含量的復(fù)方鼻炎寧滴鼻劑 9 份，分別加入甘草酸單銨鹽對(duì)照品 0．8，1．0，1．2 mL，按供試品溶液方法制備，在上述條件下進(jìn)行含量測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率99．44%，RSD為0．61%(n=9)。

2．1．4 樣品含量測(cè)定

照擬訂的含量測(cè)定方法，對(duì)3批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。以3批樣品平均含量80%作為本品含量的下限，即每1 mL含甘草酸不得低于2．03 mg。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果(g/L，n=2)

2．2 木蘭脂素

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Diamonsil(鉆石)C18柱(200 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-四氫呋喃-水(39∶1∶60);流速:1．0 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):278 nm;進(jìn)樣量:10 μL。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液均有相應(yīng)的峰出現(xiàn)，在木蘭脂素相應(yīng)的保留時(shí)間處陰性對(duì)照品溶液無(wú)吸收峰，處方中的其他成分不影響木蘭脂素的含量測(cè)定(見(jiàn)圖2)。

2．2．2 溶液制備

取木蘭脂素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含木蘭脂素對(duì)照品16 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。精密吸取本品5 mL，置25 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯約20 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，再加入乙酸乙酯至刻度，搖勻，萃取，取上層5 mL加入中性氧化鋁柱(100～200目，2 g，內(nèi)徑9 mm，濕法裝柱，用乙酸乙酯5 mL預(yù)洗)，用甲醇15 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。按處方比例根據(jù)本品制備工藝，制備不含辛夷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備成陰性對(duì)照品溶液。

圖2 高效液相色譜圖

2．2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取木蘭脂素對(duì)照品8．40 mg，置l0 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。用甲醇分別稀釋至質(zhì)量濃度為:1．68，3．36，8．4，16．8，33．6 μg/mL。精密吸取對(duì)照品溶液 10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，回歸方程為 Y=0．000 2 X-0．007 9，r=0．999 7(n=5)。結(jié)果表明，木蘭脂素質(zhì)量濃度在1．68～33．6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果木蘭脂素峰面積 RSD為0．49%(n=6)，表明方法精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同批樣品，按上述供試品溶液的制備方法制備6份溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果木蘭脂素含量的RSD為1．11%，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h 時(shí)進(jìn)樣10 μL。結(jié)果木蘭脂素峰面積 RSD為0．35%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密量取2 mL已知含量的復(fù)方鼻炎寧滴鼻劑 9 份，分別加入木蘭脂素對(duì)照品 0．8，1．0，1．2 mL，按供試品溶液方法制備，在上述條件下進(jìn)行含量測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率100．95%，RSD為0．83%(n=9)。

2．2．4 樣品含量測(cè)定

按擬訂的含量測(cè)定方法，對(duì)3批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。以3批樣品平均含量的80%作為本品含量的下限，即每1 mL含木蘭脂素不得低于0．334 mg。

3 討論

在制備供試品溶液時(shí)，對(duì)甘草酸、木蘭脂素的提取溶劑、提取時(shí)間、提取方法均進(jìn)行了考察，優(yōu)選出最佳制備方法，根據(jù)二極管列陣檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果，并參照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》辛夷項(xiàng)下木蘭脂素的測(cè)定方法及相關(guān)文獻(xiàn)資料[1，10]，選擇278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。并對(duì)流動(dòng)相、色譜柱進(jìn)行選擇，使保留時(shí)間、分離度和理論塔板數(shù)達(dá)到要求。方法學(xué)考察結(jié)果表明，方法簡(jiǎn)便可行，專屬性好，檢測(cè)結(jié)果可靠。

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