張曉梅，潘 宇，魏 勉，顧方樂(lè)，呂 芳，孫 燕，董乃俊，王大新

（江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225001）

殼聚糖是由蝦、蟹殼提取的高分子化合物幾丁質(zhì)經(jīng)脫N-乙酰后衍生而成，具有良好的生物相容性和生物學(xué)活性，是一種新型的醫(yī)用生物材料[1-2]。本試驗(yàn)旨在確定殼聚糖溶液在體外環(huán)境下對(duì)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的影響，為殼聚糖作為節(jié)育器材料提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

RPMI-1640型培養(yǎng)基（Sigma公司）；胰蛋白酶（Difco公司）；FBS（Hyclone 公司）；MTT（Sigma 公司）。殼聚糖（劑型為干粉，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，商品名為脫乙酰醫(yī)藥級(jí)殼聚糖，生產(chǎn)批號(hào)為魯衛(wèi)食證字＜2007＞第370000-000052號(hào)）。人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞（上海復(fù)祥生物科技有限公司）Cell proliferation ELISA Kit（Roche），細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天公司）。

1．2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：在37℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基。

殼聚糖溶液配制：取殼聚糖干粉2．0 g，加入蒸餾水100 mL，再加入冰醋酸1 mL，磁力攪拌24 h，待殼聚糖完全溶解后高速離心（10 000 r／min）20 min，取上清液，得質(zhì)量濃度為 20 μg／μL 的殼聚糖溶液。

MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，1×104細(xì)胞／孔。24 h后加入質(zhì)量濃度梯度的殼聚糖溶液，同時(shí)加入20%的FBS和5 μg／mL的阿霉素（DOX）溶液分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，刺激48 h后加入 20 μL 的 MTT（5 g／L），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄 MTT 溶液，每孔加入150 μL的 DMSO，震蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，570 nm波長(zhǎng)處，檢測(cè)光吸光度。

BrdU檢測(cè)DNA合成速率：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，1×104個(gè)細(xì)胞／孔。24 h后加入質(zhì)量濃度梯度的殼聚糖溶液，同時(shí)加入5 μg／mL的阿霉素作為陰性對(duì)照，刺激48 h后加入10 μmol／L的BrdU，孵育8 h后用Roche ELISA Kit檢測(cè)BrdU吸光度。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，1×104個(gè)細(xì)胞／孔。24 h后加入質(zhì)量濃度梯度的殼聚糖溶液，同時(shí)加入5 μg／mL的DOX作為陰性對(duì)照，刺激48 h后收集細(xì)胞，70%乙醇4℃固定過(guò)夜，PI染色后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

為了檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，分別用 0，0．01，0．1，1，10，50，100 μg ／mL 的殼聚糖溶液刺激Ishikawa細(xì)胞 48 h，同時(shí)以 20%FBS和 5 μg／mL的 DOX處理 48 h作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。從圖1可以看出，殼聚糖質(zhì)量濃度低于 100 μg／mL時(shí)，對(duì) Ishikawa細(xì)胞的增殖幾乎沒(méi)有明顯影響（P＞0．05）；而殼聚糖質(zhì)量濃度為 100 μg／mL時(shí)與對(duì)照組比較，Ishikawa細(xì)胞增殖能力顯著增加（P＜0．05），同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組20%FBS細(xì)胞增殖能力也顯著增加（P＜0．05），而DOX處理組細(xì)胞增殖能力極顯著降低（P＜0．01）。

圖1 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞增值的影響

2．2 殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞DNA合成速率的影響

為了檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞DNA合成速率的影響，分別用 0，0．01，0．1，1，10，50，100 μg ／mL 的殼聚糖溶液處理Ishikawa細(xì)胞48 h，同時(shí)用5 μg／mL的阿霉素處理48 h作為陰性對(duì)照，加入 1 μmol／L的 BrdU孵育 8 h，用 Roche ELISA Kit檢測(cè)。從圖2可以看出，低質(zhì)量濃度的殼聚糖（不大于10 μg／mL）時(shí)，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞的DNA合成速率沒(méi)有顯著性變化（P ＞0．05）；而殼聚糖質(zhì)量濃度達(dá)到 100 μg／mL 時(shí)，對(duì)細(xì)胞 DNA的合成速率有顯著的促進(jìn)作用（P＜0．05）。同時(shí)，DOX處理組 DNA合成速率顯著降低（P＜0．01）。

圖2 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞DNA合成速率的影響

2．3 殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響

為了檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響，分別用 0，0．1，1，10 μg／mL 的殼聚糖溶液刺激 Ishikawa 細(xì)胞48 h，同時(shí)用5 μg／mL的阿霉素刺激48 h作為陰性對(duì)照，收集的細(xì)胞用70%的乙醇于4℃固定過(guò)夜，隨后PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。從表1和圖3可以看出，≤10 μg／mL質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞的細(xì)胞周期幾乎沒(méi)有影響（P ＞ 0．05），即 0．1，1，10 μg／mL 質(zhì)量濃度殼聚糖處理組的細(xì)胞G1期，S期以及G2期與對(duì)照組比較無(wú)顯著性變化。而DOX處理組細(xì)胞無(wú)S期，同時(shí)G1期，G2期顯著延長(zhǎng)，與對(duì)照組比較有顯著性差異（P ＜0．05）。

圖3 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響

表1 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響(百分率／%)

3 討論

殼聚糖是利用蝦蟹外殼廢棄物質(zhì)制成的天然高分子化合物，具有良好的生物相容性，可在人體內(nèi)完全吸收，無(wú)毒副作用，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[3-4]。體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)表明，殼聚糖具有選擇性抑制成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖和促進(jìn)表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[5-7]，但對(duì)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

在本研究中，首先通過(guò)MTT比色法檢測(cè)了殼聚糖對(duì)Ishikawa細(xì)胞毒性的影響，發(fā)現(xiàn)僅當(dāng)殼聚糖溶液質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg／mL時(shí)才能輕微地促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的生長(zhǎng)，而當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度低于100 μg／mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響。同時(shí)，用BrdU摻入法來(lái)檢測(cè)殼聚糖溶液對(duì)Ishikawa細(xì)胞DNA合成的影響，試驗(yàn)表明，殼聚糖溶液質(zhì)量濃度高于50 μg／mL后，Ishikawa細(xì)胞DNA合成速率有輕微增加，但低于50 μg／mL時(shí)對(duì)DNA合成速率則無(wú)明顯影響。MTT和BrdU試驗(yàn)結(jié)果中，殼聚糖影響Ishikawa細(xì)胞的最低質(zhì)量濃度有所不同，其原因可能在于MTT比色法是從細(xì)胞水平來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，而B(niǎo)rdU摻入法則是從分子水平來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，故兩種方法的靈敏度不同。綜合考慮，選擇不影響Ishikawa細(xì)胞生長(zhǎng)的最低殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為10 μg／mL。最后，又用不同質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液處理Ishikawa細(xì)胞后，PI（碘化丙啶）染色，細(xì)胞流式儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，其結(jié)果與前面結(jié)果一致，即當(dāng)殼聚糖溶液質(zhì)量濃度低于10 μg／mL時(shí)，對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期沒(méi)有明顯影響。

綜上所述，低濃度的殼聚糖溶液（≤10 μg／mL）對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa的生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期都沒(méi)有明顯影響，這一特性使得殼聚糖可以作為宮內(nèi)節(jié)育器的支架。

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