彭勇 陳勇 鄔秀娣 羅晶 張振 黃嫻倩 干敏芝

HIF-1α及VEGF在類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞中的表達及意義

彭勇 陳勇 鄔秀娣 羅晶 張振 黃嫻倩 干敏芝

目的 研究類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者滑膜細胞在體外常氧和缺氧培養(yǎng)條件下缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的差異性及意義。 方法 對RA患者及骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者的關(guān)節(jié)滑膜細胞在體外常氧和缺氧條件下分別進行培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)條件分為常氧組、缺氧6h組及缺氧12h組；采用免疫印跡法分別檢測各組成纖維樣滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達情況。結(jié)果 與常氧組相比，缺氧6h及12h的RA和OA患者滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。同時RA和OA患者缺氧12h組滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達高于缺氧6h組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達均呈正相關(guān)（均P＜0.05）。常氧組RA與OA患者滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）；而缺氧6h和12h組中RA滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達均高于OA滑膜細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。 結(jié)論 在缺氧條件下RA患者滑膜細胞HIF-1α及VEGF表達顯著升高且密切相關(guān)，可能缺氧—HIF-1α—VEGF這一信號途徑在RA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

類風濕性關(guān)節(jié)炎 骨關(guān)節(jié)炎 滑膜細胞 缺氧誘導因子-1α 血管內(nèi)皮生長因子

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種 慢性系統(tǒng)性的以侵蝕性關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫病，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎和血管翳的形成。而骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種最為常見的慢性關(guān)節(jié)退行性疾病，其特征在于關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞以及軟骨下骨的改變。目前的研究已經(jīng)證實RA受累關(guān)節(jié)微環(huán)境中存在缺氧[1]；并發(fā)現(xiàn)缺氧在RA血管新生中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，包括誘導炎癥細胞的浸潤及炎癥因子[如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）]的產(chǎn)生[2]。體內(nèi)細胞缺氧反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)因子是缺氧誘導因子（HIF-1α）。缺氧時，HIF-1α可以激活40多種低氧適應(yīng)性基因的表達，在RA成纖維細胞中參與能量代謝、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、血管生成、免疫及炎癥反應(yīng)等的調(diào)節(jié)基因的表達均被上調(diào)[3]。VEGF是一種較強的刺激血管新生的物質(zhì)，在血管新生中起著核心的作用。近年來有學者提出關(guān)節(jié)滑膜的炎癥在OA的發(fā)病過程中也起著十分重要的作用，尤其在發(fā)病的早期[4]；新生血管的形成也參與了OA關(guān)節(jié)軟骨的破壞[5]。因此，HIF-1α和VEGF可能在RA和OA的發(fā)病過程中均起著重要的作用。筆者采用蛋白免疫印跡法（Western blot）體外檢測RA和OA患者成纖維樣滑膜細胞在常氧和缺氧培養(yǎng)條件下HIF-1α和VEGF蛋白表達水平，分析兩者表達的差異性及相關(guān)性，探討其在RA發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 無菌獲取寧波市第二醫(yī)院及寧波市第六醫(yī)院關(guān)節(jié)外科行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA和OA患者各9例的滑膜組織。RA患者中男2例，女7例，年齡42～64歲，平均（54.3±10.5）歲；均符合2010年美國風濕病學會/歐洲風濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）的類風濕新關(guān)節(jié)炎分類標準[6]。OA患者中男4例，女5例，年齡54～75歲，平均（60.6±8.7）歲；均符合1995年ACR的OA診斷標準[7]。標本獲取前經(jīng)兩家醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，且均獲得患者同意并簽訂知情同意書。標本獲取后置于盛有20ml無血清的DMEM培養(yǎng)基的50ml離心管中，2h內(nèi)運送至實驗室進行處理。

1.2 主要試劑和儀器 眼科剪；眼科鑷；細胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶（美國NUNC公司）；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）（美國Hyclone/Thermo Scientific公司）；Tris-HCl緩沖液（TBS）及含0.2%吐溫的TBS緩沖液（上海索萊寶公司）；總蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；兔抗人HIF-1α多克隆抗體（一抗）（美國Cell Signaling公司）；兔抗人VEGF多克隆抗體（一抗）（美國Canta Cruz公司）；兔抗人β-actin單抗（一抗）及鼠抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Western Bright Quantum增強型發(fā)光底物（APG BIO環(huán)亞生物科技有限公司）；Bio-Rad蛋白凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Thermo Scientific轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Thermo公司）；Tanon-4200SF全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（中國上海天能儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 滑膜細胞培養(yǎng) 將無菌的滑膜組織于生物安全柜中，在100mm細胞培養(yǎng)皿中用眼科剪和鑷子去除組織塊表面血污及脂肪組織，PBS緩沖液清洗2遍。將組織塊轉(zhuǎn)移至新的盛有DMEM培養(yǎng)基（含抗生素）的培養(yǎng)皿內(nèi)，用新的眼科剪和鑷子將組織塊剪成1mm3的小塊；用槍頭或者眼科彎鑷，將組織塊擺放至新的25cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，間隔1cm左右，將培養(yǎng)瓶倒置（組織塊面朝上）于細胞培養(yǎng)箱中。孵育4h后向瓶內(nèi)加入含15% FBS和青、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基5ml，然后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)讓培養(yǎng)基浸沒組織塊，置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h后換液，以后每隔2～3d換液。培養(yǎng)期間偶有組織塊離壁、漂浮，即時換液去除漂浮組織塊。待細胞匯集占瓶底面積90%時采用0.25%胰酶常規(guī)消化傳代，實驗所用滑膜細胞均采用第3～5代滑膜細胞。

1.3.2 實驗分組 將生長至90%左右的RA和OA第3～5代滑膜細胞均分為常氧組、缺氧6h組和缺氧12h組，分別將細胞置于常氧條件下（21%O2+5%CO2）和缺氧條件下（1%O2+5%CO2）培養(yǎng)6、12h。

1.3.3 Western blot檢測 分別收集各實驗組細胞，嚴格按試劑盒操作說明提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。取30μg總蛋白，加入適量的上樣緩沖液混勻，沸水浴中煮沸5min備用。制備SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣。蛋白電泳：分離膠恒壓80V 20min，濃縮膠恒壓100V 90min；轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜前將濾紙于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20min，恒流41mA半干轉(zhuǎn)2h，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。將膜置于5%BSA封閉液中封閉1h；采用TBST洗膜2次，每次10min，TBS洗膜1次，10min；加待測的相應(yīng)目的蛋白的一抗（抗HIF-1α或抗VEGF抗體），4℃過夜孵育，同上洗膜；加二抗，室溫孵育1h，同上洗膜。ECL發(fā)光劑發(fā)光，Tanon-4200 SF全自動數(shù)碼凝膠成像儀中，CCD曝光成像。凝膠圖像分析軟件對結(jié)果進行吸光度掃描，以β-actin做內(nèi)參進行校正，以HIF-1α和VEGF蛋白條帶的吸光度值比上各自β-actin的吸光度值為目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；兩組間的比較采用t檢驗。兩種蛋白表達水平相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 滑膜細胞生長情況 組織塊生長至第4天可見組織塊周圍有成纖維樣細胞爬出，培養(yǎng)第10天可見大量細胞圍繞組織快生長；培養(yǎng)至第16天可傳至第1代，見圖1、2。

圖1 RA原代滑膜細胞生長第4天

圖2 RA原代滑膜細胞生長第10天

2.2 RA和OA患者滑膜細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達情況 RA和OA患者滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白的Western blot結(jié)果見圖3、4。與常氧組相比，RA和OA缺氧6h組及缺氧12h組的滑膜細胞HIF-1α和VEGF蛋白表達均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而常氧條件下兩者的滑膜細胞HIF-1α和VEGF蛋白幾乎不表達。與缺氧6h組相比，缺氧12h組RA及OA滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達也均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。此外，常氧組RA和OA兩者的HIF-1α和VEGF蛋白表達的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；而缺氧6h組和缺氧12h組中RA滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達要高于同組的OA滑膜細胞的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），詳見表1。

圖3 RA患者電泳凝膠圖

圖4 OA患者電泳凝膠圖

表1 RA和OA患者滑膜細胞常氧和缺氧條件下的HIF-1和VEGF表達情況

2.3 RA和OA滑膜細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達的相關(guān)性 分別將RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白Western Blot結(jié)果進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)RA患者3組滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.971，P＜0.05）；OA患者滑膜細胞的VEGF表達與HIF-1α的表達也呈正相關(guān)（r=0.759，P＜0.05）。

3 討論

關(guān)節(jié)滑膜炎是RA關(guān)節(jié)炎的基本病理改變，關(guān)節(jié)滑膜的增厚、大量炎癥細胞的浸潤及炎癥因子的釋放造成了關(guān)節(jié)微環(huán)境的缺氧，從而導致了新生血管及血管翳形成。血管翳具有類似腫瘤組織侵蝕的特性，最終將導致關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞。血管翳的形成在RA的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，而體內(nèi)細胞缺氧反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)因子是HIF-1α。Brouwer等[8]應(yīng)用重復染色方法對RA及OA的患者滑膜組織進行對照研究，發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織襯里下層高表達HIF-1α，相反地OA滑膜組織細胞HIF-1α表達較低；同時還發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織HIF-1α陽性細胞數(shù)與其血管數(shù)目、炎癥細胞浸潤數(shù)呈正相關(guān)。有研究也表明，早期活動組RA患者的血清HIF-1α要顯著高于OA患者組及健康對照組，并且高于中晚期活動組及穩(wěn)定組RA患者[9]。同時有學者還發(fā)現(xiàn)RA患者血清中VEGF表達顯著增高且與患者受累關(guān)節(jié)滑膜呈正相關(guān)[10]。OA是以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞以及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病。類似的大量研究也發(fā)現(xiàn)OA患者受累關(guān)節(jié)中氧濃度顯著降低[11]。同時有學者對OA患者、急性創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎及正常人滑膜組織共60例，進行HIF-1α、VEGF免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)OA患者組的HIF-1α及VEGF表達要顯著高于其他兩組，且兩者的表達呈正相關(guān)[12]。

本研究通過對RA和OA患者滑膜細胞進行體外細胞原代培養(yǎng)，采用Western blot檢測其不同條件下HIF-1α及VEGF蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)RA和OA患者缺氧6h組及缺氧12h組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF蛋白表達顯著高于常氧組，而常氧組的HIF-1α及VEGF幾乎不表達；與缺氧6h組相比，兩者滑膜細胞的HIF-1α及VEGF蛋白也隨之增加。同時對HIF-1α及VEGF的表達進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF蛋白表達呈正相關(guān)，以上結(jié)果均表明關(guān)節(jié)微環(huán)境的缺氧可以誘導滑膜細胞HIF-1α的高表達，進而促進VEGF的表達而產(chǎn)生作用。筆者推測，缺氧的持續(xù)存在促使了HIF-1α和VEGF蛋白的表達進一步升高，從而可能加劇了滑膜的炎癥。國內(nèi)有學者對多例RA和OA患者受累膝關(guān)節(jié)進行關(guān)節(jié)鏡檢查及滑膜組織染色分析，鏡下發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織增生及血管密度較OA患者明顯；染色發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織表達的VEGF要顯著高于OA患者，同時分析發(fā)現(xiàn)滑膜組織增生程度與VEGF水平呈正相關(guān)[13]。而本研究從細胞水平對RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF表達進行比較，發(fā)現(xiàn)RA缺氧6h組和缺氧12h組的滑膜細胞中HIF-1α及VEGF表達均高于同組OA滑膜細胞的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而兩者常氧組的表達則無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。通過文獻復習發(fā)現(xiàn)CaMKII（Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶家族之一）表達于RA的成纖維樣滑膜細胞，而CaMKII可以調(diào)節(jié)HIF-1α等因子的轉(zhuǎn)錄激活；同時發(fā)現(xiàn)CaMKII的抑制劑可以抑制RA滑膜細胞HIF-1α及VEG的表達，這可能是通過抑制pI3K/Akt信號來實現(xiàn)的[14]。pI3K/ Akt和MAPK這兩條信號途徑是介導缺氧條件下RA滑膜細胞HIF-1α轉(zhuǎn)入激活的主要磷酸化途徑[15]。類似的研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以通過抑制pI3K/Akt信號途徑進而降低RA成纖維樣滑膜細胞HIF-1α及VEG的表達[16]。同時有學者使用pI3K/Akt信號途徑抑制劑下調(diào)CIA大鼠模型的HIF-1α表達水平，發(fā)現(xiàn)其關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)、影像學改變、滑膜的增生程度及炎癥細胞的浸潤都得到顯著改善[17]。因此，在缺氧條件RA成纖維樣滑膜細胞表達相關(guān)受體可以通過多種信號途徑從而能更有效的誘導HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活[18]，從而增加缺氧條件下RA滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達。這可能解釋RA滑膜細胞在缺氧條件下HIF-1α及VEGF表達顯著高于OA滑膜細胞。

綜上所述，體外缺氧條件培養(yǎng)的RA患者成纖維樣滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達水平要高于OA患者，且兩者的表達呈正相關(guān)。因此，筆者推測缺氧誘導的HIF-1α高表達及隨后產(chǎn)生的VEGF在RA的發(fā)病過程中起著十分重要的作用；而缺氧—HIF-1α—VEGF這一信號通路可能與RA的發(fā)生、發(fā)展有著十分密切的關(guān)系，通過改善缺氧、阻斷這一信號通路、拮抗HIF-1α及VEGF表達可能成為RA治療的新思路。

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Expression of HIF-1α and VEGF on fibroblast-like synoviocytes cells in patients with rheumatoid arthritis

Objective To investigate the expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)and vascular endothelial growth factor(VEGF)on fibroblast-like synoviocytes cells in rheumatoid arthritis and its correlation with normoxia and hypoxia. Methods Primarily cultured fibroblast-like synoviocytes cells from patients with rheumatoid arthritis(RA)and osteoarthritis(OA) were exposed to normoxia for 6h or hypoxia for 6h and 12h.The expression of HIF-1α and VEGF were detected by Western blot. Results The expressions of HIF-1α and VEGF in fibroblast-like synoviocytes cells from RA or OA patients exposed to hypoxia for 6h and 12h were higher than those exposed to normoxia(P＜0.05).Compared to those exposed to hypoxia for 6h,the expression of HIF-1α and VEGF in cells exposed to hypoxia for 12h was higher(P＜0.05).The expression of HIF-1α was positively correlated with VEGF in three groups(P＜0.05).The expressions of HIF-1α and VEGF in fibroblast-like synoviocytes cells from RA patients exposed to hypoxia for 6h and 12h were higher than those from OA patients correspondingly(P＜0.05),however, there were no significant difference in normoxic group between RA and OA patients(P＞0.05).Conclusion In hypoxia conditions the expressions of HIF-1α and VEGF on fibroblast-like synoviocytes cells from RA patients are significantly higher than those from OA patients,indicating that Hypoxia—HIF-1α—VEGF signaling pathway may be closely related to the occurrence and development of RA.

Rheumatoid arthritis Osteoarthritis Synoviocytes Hypoxia-inducible factor-1α Vascular endothelial growth factor

2013-07-16）

（本文編輯：嚴瑋雯）

（本文由浙江省醫(yī)學會風濕病學分會推薦）

寧波市社會發(fā)展科研項目基金資助（2012C50010）；寧波市自然基金項目資助（2013A610259）

315010 寧波市第二醫(yī)院風濕免疫科(彭勇、陳勇、鄔秀娣、張振、黃嫻倩、干敏芝)；寧波市第六醫(yī)院風濕免疫科（羅晶）

陳勇，E-mail：nbdyyycy@163.com.