王曉娟

丹參多酚酸鹽(salvianolate)為丹參的水提物，其主要成分為丹參乙酸鎂(magnesium lithospermate B)。文獻(xiàn)報(bào)道［1-2］丹參多酚酸鹽對(duì)缺血性疾病有明顯的療效，對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞有促遷移及增殖的作用。骨折的愈合一直是學(xué)者們長(zhǎng)期研究的難題［3］。骨折愈合過程中，骨折端新生血管的長(zhǎng)入是其重要的步驟之一［4-5］，干細(xì)胞的歸巢是骨折修復(fù)的重要來源［6-7］。如果提高干細(xì)胞的促新生血管形成能力，將大大提高骨折的愈合能力。本研究采用細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，觀察丹參多酚酸鹽對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及與血管形成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)情況，初步探討中藥對(duì)促骨折愈合的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(賽業(yè)生物科技有限公司，廣州，中國);DMEM 培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司，廣州，中國);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物公司);丹參多酚酸鹽(上海綠谷生醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20050246);VEGF 及GAPDH 引物均購自上海生物工程有限公司;TRIzol(Invitogen 公司，加利福尼亞，美國)，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO Life Science，東京，日本);SYBR?Green Real time PCR master Mix-Plus(TOYOBO Life Science，東京，日本)。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào)DH-801 上海三騰儀器有限公司，上海，中國);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(型號(hào)RJ17DG5033A 中西集團(tuán)，遼寧沈陽，中國);紫外分光光度計(jì)(Beckman DU530 Germany);StepOneTMReal-Time PCR System(Applied Biosystems Company，Carlsbad，USA)。

1.3 分組

實(shí)驗(yàn)組為丹參多酚酸鹽與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)共培養(yǎng);對(duì)照組為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況 實(shí)驗(yàn)組為丹參多酚酸鹽(0.5 mg/ml)與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(P2代)5×104在六孔板中共培養(yǎng)，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5×104在六孔板中培養(yǎng)做為對(duì)照組。用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基在37℃飽和濕度及5%二氧化碳孵育箱中分別進(jìn)行共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)48 小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4.2 MTT 檢測(cè) 用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5 000 個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。培養(yǎng)細(xì)胞同一般培養(yǎng)條件，分別于第1、3、5、7 天，每組分別取5 個(gè)孔，每孔加MTT 溶液(5 mg/ml 用PBS 配)20 μl。繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4.3 細(xì)胞VEGF mRNA 檢測(cè) 將培養(yǎng)7 天后的細(xì)胞用胰酶消化后收集。于勻漿器中加入1 ml Trizol，充分研磨后靜置15 分鐘，經(jīng)氯仿萃取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌后加入30 μl DEPC 水溶解提取總RNA，用分光光度儀檢測(cè)RNA 純度及濃度。反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增均選用東洋紡試劑盒，按其說明書步驟進(jìn)行。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60 秒，三步法:95℃15秒，58℃15 秒，72℃45 秒40 個(gè)循環(huán)。VEGF 引物:上游引物5’-GCGGGCTGCCTCGCAGTC-3’，下游引物5’-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3’，GAPDH 上游引物5’-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游引物5’-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3’，以GAPDH為內(nèi)參照，根據(jù)熒光定量PCR 儀顯示的CT 值結(jié)果，以對(duì)照組做參照通過2-ΔΔCt方法計(jì)算RQ 值分析兩組相對(duì)基因表達(dá)差異。

圖1 顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況(×100)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞顯微鏡下觀察結(jié)果

兩組細(xì)胞在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察，兩組培養(yǎng)細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)污染及支原體感染跡象，100 倍顯微視野下見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密集程度明顯高于對(duì)照組，見圖1。

2.2 MTT 測(cè)定結(jié)果

兩組細(xì)胞在體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第1、3、5、7 天均呈明顯上升趨勢(shì)，細(xì)胞生長(zhǎng)第一天兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組于第三天后均高于對(duì)照組。P ＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明丹參多酚酸鹽對(duì)BMSC 有促增殖作用，見圖2。

2.3 qRT-PCR 測(cè)定結(jié)果

提取RNA，稀釋100 位后用分光光度儀檢測(cè)A260 及A280 的OD 值，求得A260/A280 比值在1.8 ～2.0 之間，說明RNA 純度較高。據(jù)A260 的OD 值計(jì)算得RNA 濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增后行熒光定量，獲得CT 值，計(jì)算RQ 值，結(jié)果見圖3。丹參多酚酸鹽與BMSC 共培養(yǎng)組(Exp)的VEGF mRNA 表達(dá)量明顯高于BMSC 單獨(dú)培養(yǎng)組(Con)。

3 討論

丹參為唇形科鼠尾草屬植物干燥的根及根莖，有“一味丹參，功同四物”之美譽(yù)。作為經(jīng)典的傳統(tǒng)中藥材，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰和養(yǎng)血安神的功效［8］。臨床上多用于治療缺血性疾病，研究證實(shí)其治療機(jī)制與促血管生成相關(guān)［9］。丹參多酚酸鹽為丹參的水溶性提取物，具有有效成分明確、質(zhì)量易控以及療效穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。較中醫(yī)藥的復(fù)方合劑有效成份更純更有效，并減少了期副作用［10］。中醫(yī)認(rèn)為，骨折的愈合過程是一個(gè)“瘀去、新生、骨合”的過程。根據(jù)骨折的證候特點(diǎn)，可分為消淤退腫期、活血生新期及固本培元期。而在骨折發(fā)生后1 ～2 周內(nèi)，由于肢體內(nèi)部筋骨脈絡(luò)均受損傷，離經(jīng)之血淤積不散、氣血之道不得暢通，故疼痛劇烈，患部淤血腫脹，治宜活血化淤，消腫止痛。

作為一種復(fù)合材料，骨組織生長(zhǎng)的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括分子、細(xì)胞、生化代謝的變化［11］。骨折的直接反應(yīng)是血腫的形成和炎癥反應(yīng)，血腫形成，阻止更多的流血和損耗因子。炎癥反應(yīng)提供兩骨端初始穩(wěn)定，啟動(dòng)多個(gè)愈合過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。前體細(xì)胞侵入骨折端之間并形成新的血管，成纖維細(xì)胞，和其他支持細(xì)胞肉芽組織形成。MSCs遷移至骨折端后分化為前體細(xì)胞，釋放的細(xì)胞因子具特異性抗炎作用并促新生血管生成［12］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的招募及遷移至骨折部位可有效促進(jìn)骨折的修復(fù)已達(dá)成共識(shí)［13］。如果能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及提高其血管生成的能力必將提高骨折的修復(fù)能力。VEGF 作為目前研究較清楚，作用最明確的促血管生長(zhǎng)因子，其作用是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，合成后以旁分泌形成發(fā)揮生物效應(yīng)［2］。目前所報(bào)道的與血管生成有關(guān)的因子許多均與VEGF 的表達(dá)相關(guān)。提高VEGF 的表達(dá)則說明進(jìn)一步促新生血管形成。本實(shí)驗(yàn)對(duì)基因表達(dá)的研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的定量分析，其定量分析的準(zhǔn)確度和靈敏度均遠(yuǎn)高于以前的方法。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參多酚酸鹽促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并可上調(diào)其表達(dá)VEGF mRNA 水平，進(jìn)而促進(jìn)血管生成。丹參多酚酸鹽在促血管生成的同時(shí)還對(duì)腦、肝、腎、肺等組織有保護(hù)作用，符合中醫(yī)對(duì)骨折的全身施治的辨證治療原則，具有良好的發(fā)展前景。關(guān)于其對(duì)骨折早期促進(jìn)愈合作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還有待于進(jìn)一步研究。

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