韓樹山 吳愛明 張冬梅 呂唏瀅 趙明鏡 柴立民 聶波 金秋碩 趙一舟王碩仁 婁利霞

心力衰竭是一個由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血減少的復(fù)雜臨床綜合征。中醫(yī)治療心力衰竭具有一定的特色和優(yōu)勢。中醫(yī)認為心力衰竭的病因病機為本虛標(biāo)實、氣虛陽虛為本，血瘀水泛為標(biāo)。其中又以氣虛血瘀為主。益氣活血方以人參、黃芪、當(dāng)歸為組分，在以往的研究中證實可以降低心肌梗死的死亡率，提高冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的運動耐量［1］。為了進一步探討益氣活血方改善心功能的作用機制，本實驗在在體的心力衰竭模型上，觀察益氣活血方處理對心力衰竭時心功能的影響及其細胞凋亡機制，以論證益氣活血方對心力衰竭心臟的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量(200±10)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗動物質(zhì)量合格證號:SCXK(京)2009-0007。

1.2 藥物的制備

益氣活血方由人參1 g、黃芪13 g 和當(dāng)歸6 g 組成，藥物使用免煎顆粒，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院。常溫干燥保存。

1.3 儀器

RSP-1002 型呼吸機(Kent Scientific Corporation)，心電示波儀(上海醫(yī)學(xué)電子儀器廠XJ-11型)，千分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司JA1003N 型)，中日合資AloCa5000 彩色超聲診斷儀，CL15-7 高頻線陣探頭(7-15MHz)，BX60 熒光透射顯微鏡(日本Olympus 公司)，SpotⅡ數(shù)碼成像系統(tǒng)(美國Diagnostic Instruments 公司)，IpWin5 圖象分析軟件。

1.4 動物模型制備［2］

大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 體重腹腔麻醉后，背位固定，左胸前區(qū)備皮，消毒。經(jīng)喉行氣管插管術(shù)，連接呼吸機，80 次/分鐘，潮氣量0.7 ～0.8 ml，在左側(cè)第三四肋骨間橫向切開皮膚約1.5 cm，鈍性分離肌層，沿第三四肋骨間隙打開胸腔，開胸器固定。打開心包，暴露心臟。在動脈圓錐左心耳之間下方約2 mm 處用5/0 線結(jié)扎左冠狀動脈前降支。當(dāng)心電圖I 導(dǎo)聯(lián)顯示ST 段顯著抬高后，重置心臟于胸腔，并立即分層縫合胸壁。術(shù)后注射青霉素(80萬單位/只)連續(xù)3 天。假手術(shù)組手術(shù)過程同上，但只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈。模型組和假手術(shù)組動物術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 動物分組及給藥

大鼠左冠狀動脈結(jié)扎手術(shù)死亡率20%。成活的模型大鼠隨機分為益氣活血低劑量組、益氣活血高劑量組、生理鹽水對照組和西藥對照組(酒石酸美托洛爾)，每組8 只。按如下方法給藥:益氣活血低劑量組按2 g/(kg·d)給藥劑量灌胃益氣活血高劑量組按20 g/(kg·d)灌胃，酒石酸美托洛爾組按12 mg/(kg·d)給藥劑量灌胃，生理鹽水對照組、和正常組大鼠給以和治療組同等容積的生理鹽水灌胃，每日一次，于造模后24 小時開始，連續(xù)給藥8 周后進行小動物心動超聲檢測以及心臟組織取材。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 大鼠超聲心動圖測定 大鼠連續(xù)給藥8 周后，1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 體重腹腔麻醉，仰臥位固定于鼠板，胸部備皮，應(yīng)用超聲診斷儀和高頻線陣探頭檢測心臟結(jié)構(gòu)和功能。心臟的檢測:取胸骨旁左室長軸切面，由二維超聲引導(dǎo)M 型曲線進行測量。超聲測定指標(biāo):(1)左室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall end-diastole thickness，LVPWTd)、左室后壁收縮末期厚度(left ventricular posterior wall end-systolic thickness，LVPWTs)、室間隔舒張末期厚度(interventricular septum end-diastolic thickness，IVSTd)、室間隔收縮末期厚度(interventricular septum end-systolic thickness，IVSTs);(2)左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter LVDs);(3)左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)左室短軸縮短分數(shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)。以上每一項超聲測定指標(biāo)均取3 個測量值后取平均值。

表1 大鼠冠狀動脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動超聲檢測的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

表1 大鼠冠狀動脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動超聲檢測的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別 n 度左(室L后V P壁W舒T d張)(末cm厚)度左(室L后V P壁W收T s縮)(末cm厚)室(間I V隔ST舒d)張(c厚m)度 室(間IV隔ST收s)縮(c厚m)度左室(L舒VD張d末)(期cm內(nèi))徑左室(L收VD縮s)末(期c m內(nèi))徑假手術(shù)組 8 0.17±0.03 0.28±0.04 0.15±0.03 0.32±0.05 0.70±0.05 0.36±0.05模型組 8 0.19±0.03 0.25±0.03 0.17±0.05 0.24±0.07a 0.81±0.09b 0.58±0.07b酒石酸美托洛爾組 8 0.22±0.06 0.27±0.06 0.16±0.04 0.21±0.07 0.84±0.09 0.60±0.09益氣活血小劑量組 8 0.21±0.04 0.29±0.06 0.18±0.02 0.27±0.06 0.81±0.11 0.51±0.13益氣活血大劑量組 8 0.20±0.03 0.26±0.03 0.18±0.03 0.25±0.08 0.85±0.04 0.59±0.10

1.6.2 大鼠臟體比值的測定 大鼠連續(xù)給藥8周，實驗完畢后剪取大鼠心臟，用生理鹽水沖洗殘余的血液，輕輕擠出殘余液體，用電子天平稱量全心重量(HW)，計算心臟臟體比值。心臟臟體比值(mg/g)=全心重量(HW)/體重(g)

1.6.3 TUNEL 染色(參照武漢博士德生物制品公司試劑盒說明) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫，室溫處理10 分鐘后蛋白酶K 37 ℃消化10 分鐘。新鮮配制標(biāo)記緩沖液37 ℃孵育2 小時，封閉液室溫封閉30 分鐘。生物素化地高辛抗體37 ℃反應(yīng)30 分鐘，0.01 mol/L TBS 洗。鏈霉親和素-過氧化物酶(SABC)37 ℃反應(yīng)30 分鐘，0.01 mol/L TBS洗5 分鐘×4 次。加3，3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色。輕度蘇木素復(fù)染細胞核。脫水，透明，封片光鏡檢查。用PBS 做陰性對照，陽性為棕黃色。選取非梗死區(qū)域進行TUNEL 陽性細胞占總細胞的百分比計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)后給藥8 周心動超聲檢測

通過小動物超聲心動圖觀察檢測心臟結(jié)構(gòu)變化及其收縮和舒張功能。在冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后8周，大鼠的心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生了重構(gòu)，與假手術(shù)組比，模型組大鼠的心臟LVDd、LVDs 顯著增加(P ＜0.05)，與模型組相比，各藥物組對超聲心動的各形態(tài)學(xué)指標(biāo)沒有影響(P ＞0.05)。與假手術(shù)組比，模型組大鼠的心臟LVEF%、LVFS%顯著降低(P ＜0.05)，與模型組比，給予益氣活血方小劑量可以顯著改善LVEF%、LVFS%(P ＜0.05)，而大劑量益氣活血方有改善LVEF%、LVFS%的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1、表2。

表2 大鼠冠狀動脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動超聲檢測的功能學(xué)指標(biāo)

表2 大鼠冠狀動脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動超聲檢測的功能學(xué)指標(biāo)

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 n 左(L室VE射F血)(分%數(shù))左室(L短VF軸S縮)(短%分)數(shù)假手術(shù)組8 86.70±3.03 51.33±3.89模型組 8 57.13±13.53a 28.35±8.55a酒石酸美托洛爾組 8 61.16±9.95 30.86±5.31益氣活血小劑量組 8 72.74±9.99b 38.15±8.26b益氣活血大劑量組8 63.60±12.38 31.05±8.51

2.2 大鼠臟體比值

術(shù)后給藥8 周，測定大鼠心臟的臟體比值作為評價心肌重構(gòu)的指標(biāo)。模型組臟體比值高于假手術(shù)組，但是兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，給予酒石酸美托洛爾及益氣活血方都有降低大鼠臟體比值的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表3。

表3 各組動物心臟臟體比值

表3 各組動物心臟臟體比值

組別 n 臟體比值(mg/g)假手術(shù)組8 0.29±0.04模型組 8 0.33±0.04酒石酸美托洛爾組 8 0.30±0.05益氣活血小劑量組 8 0.29±0.02益氣活血大劑量組8 0.31±0.03

2.3 TUNEL 染色方法檢測給藥8 周后大鼠心肌組織的細胞凋亡

每組動物隨機選取6 只，做組織切片，進行TUNEL 凋亡染色。假手術(shù)組(A)大鼠的心肌細胞細胞凋亡陽性染色很少，模型組大鼠(B)心肌細胞TUNEL 染色陽性細胞核顯著增高(與假手術(shù)組比較，P ＜0.01)，酒石酸美托洛爾可以明顯抑制冠狀動脈結(jié)扎大鼠模型心肌細胞凋亡的發(fā)生(與模型組比較，P ＜0.05)。益氣活血小劑量(C)和大劑量(D)也可以明顯抑制冠狀動脈結(jié)扎大鼠模型心肌組織細胞凋亡的發(fā)生(P ＜0.05、P ＜0.01)。見圖1、表4。

表4 TUNEL 染色方法檢測給藥8 周后大鼠心肌組織的細胞凋亡陽性率

表4 TUNEL 染色方法檢測給藥8 周后大鼠心肌組織的細胞凋亡陽性率

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05，cP ＜0.01。由于每組有2 只動物取材專門用做氧化應(yīng)激損傷及分子生物學(xué)實驗，故該檢測指標(biāo)樣本量為6。

組別 n 心肌細胞凋亡陽性率(%)假手術(shù)組6 1.97±1.27模型組 6 8.86±2.35a酒石酸美托洛爾組 6 5.99±1.70b益氣活血小劑量組 6 5.96±2.41b益氣活血大劑量組 6 3.86±1.55c

3 討論

細胞凋亡是生物體內(nèi)一種與細胞壞死截然不同的自殺程序，是在基因控制下的主動死亡。研究表明心肌梗死后心室重構(gòu)和心肌由代償性肥厚到心力衰竭轉(zhuǎn)變過程中存在心肌細胞凋亡現(xiàn)象。心肌細胞的缺失(死亡和凋亡)和心室重構(gòu)是心功能下降的最主要的原因［3］。中醫(yī)針對心力衰竭氣虛血瘀的基本病機，使用益氣活血方可以改善心肌梗死后心功能［4］。

圖1 冠狀動脈結(jié)扎大鼠模型給藥8 周后心肌組織TUNEL 染色

本研究在大鼠冠狀動脈結(jié)扎模型上，給以由黃芪、人參、當(dāng)歸組成的益氣活血方，8 周后測定心功能及心肌組織細胞凋亡。結(jié)果表明:此方藥可以減輕心肌梗死后的心室重構(gòu)，改善心功能。與模型組比，給予益氣活血方小劑量可以顯著改善LVEF%、LVFS%(P ＜0.05)，大劑量益氣活血方有改善LVEF%、LVFS%的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這個結(jié)果可能與模型制備的手術(shù)操作較為復(fù)雜和實驗動物的例數(shù)限制有關(guān)。心肌組織的TUNEL 染色結(jié)果還顯示此益氣活血方抑制了細胞凋亡的發(fā)生，這可能是此方藥減輕心肌梗死后的心室重構(gòu)，改善心功能的重要機制。

本實驗所用益氣活血方的主要成分黃芪為益氣藥，大量研究表明黃芪對缺血心肌有多重保護作用。它保護線粒體及溶酶體的功能、能夠增加cAMP 的含量、降低心肌耗氧量，增加心肌抗缺氧能力，另外黃芪還具有消除自由基的作用［5］。此方藥的另一主要成分人參及其提取物人參皂苷被證實能改善心肌缺血、縮小梗死面積，對缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。有研究提示，人參可通過抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡而發(fā)揮其保護作用［6］。細胞凋亡發(fā)生的途徑有多種，包括細胞外途徑，線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。多種蛋白分子Fas，bcl-2，Bax，CHOP 等參與其中［7］。但是此益氣活血方抑制心肌梗死后心肌細胞凋亡的具體分子機制還需要進一步的深入研究。

［1］ 廖家楨．氣血理論在冠心病辨證論治中的應(yīng)用［J］．天津中醫(yī)，1985，2(1):33-36．

［2］ Barr DJ，Green HJ，Lounsbury DS，et al．Na+-K+-ATPase properties in rat heart and skeletal muscle 3 mo after coronary artery ligation［J］．J Appl Physiol，2005，99(2):656-664．

［3］ 吳立玲．心血管病理生理學(xué)［M］．北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2000:68．

［4］ 趙明鏡，王碩仁，李敏，等．早期應(yīng)用活血和益氣中藥抑制心衰大鼠左室重構(gòu)和凋亡的對比研究［J］．中國中藥雜志，2007，32(8):710-714．

［5］ 吳發(fā)寶，陳希元．黃芪藥理作用研究綜述［J］．中藥材，2004，27(3):232-234．

［6］ 曾和松，劉正湘，劉曉春．人參對大鼠缺血再灌注后心肌細胞凋亡的抑制作用［J］．中國臨床康復(fù)，2004，8(9):1784-1786．

［7］ Adams JM．Ways of dying:multiple pathways to apoptosis［J］．Genes Dev，2003，17(20):2481-2495．