陳冬梅，方芳，周園，徐靜，海曉歐，劉澤宇

(1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸科)

健康人的咽部一般會(huì)寄居一定數(shù)量和一定種類(lèi)的微生物，在臨床上醫(yī)生將其稱(chēng)為呼吸道正常菌群。呼吸道的正常菌群受宿主內(nèi)環(huán)境及自然外環(huán)境的影響，在種類(lèi)和數(shù)量上保持著一定的動(dòng)態(tài)平衡。一旦菌群正常寄居的生態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞則可導(dǎo)致菌群失調(diào)，引起呼吸道感染甚至死亡[1]。

本課題以健康人上呼吸道咽部菌群為研究基礎(chǔ)，著重探討呼吸道感染時(shí)菌群的變化及經(jīng)過(guò)5 d廣譜抗生素(三代頭孢菌素)治療后咽部菌群的演變，通過(guò)對(duì)臨床不同人群的咽部菌群種類(lèi)和數(shù)量的研究進(jìn)行對(duì)比分析，幫助臨床醫(yī)生加強(qiáng)合理使用抗生素的意識(shí)，提高綜合診治呼吸道感染疾病的水平，更深入地認(rèn)識(shí)呼吸道感染疾病的病因和本質(zhì)，對(duì)探求符合自然規(guī)律的保護(hù)呼吸道微生態(tài)新的治療理念具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集 所有標(biāo)本來(lái)源于2011年11月至2012年5月，年齡在18～35歲的沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院在校學(xué)生和老師及沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸科門(mén)診及住院患者咽拭子，共90例，男女各半。

1.2 分組及入選標(biāo)準(zhǔn) 將研究對(duì)象分為3組：健康人、呼吸道感染未治療患者、呼吸道感染經(jīng)5 d三代頭孢菌素治療后患者，每組30例。研究對(duì)象要求符合以下條件：(1)健康人群：①近2周內(nèi)無(wú)發(fā)熱、咽痛、咳嗽等呼吸道感染癥狀；②近2周內(nèi)未用過(guò)抗生素；③無(wú)吸煙史。(2)呼吸道感染未治療患者：①近2周內(nèi)未用過(guò)抗生素；②有明顯咽痛或充血，或扁桃體腫大，有膿性分泌物；③血常規(guī)白細(xì)胞總數(shù)升高或中性粒細(xì)胞增多；④有咳嗽、咳痰等呼吸道感染癥狀；⑤無(wú)吸煙史。(3)呼吸道感染廣譜抗生素治療5 d患者：①呼吸道感染后僅使用三代頭孢菌素治療的患者；②已使用5 d抗生素治療且無(wú)其它合并癥；③無(wú)吸煙史。

1.3 方法

1.3.1 咽拭子的采集與接種 采樣前讓實(shí)驗(yàn)者用無(wú)菌水漱口清潔口腔，用無(wú)菌棉拭子浸潤(rùn)無(wú)菌生理鹽水，擠出多余水分后在無(wú)菌壓舌板幫助下使咽部充分暴露，在受試者咽后壁旋轉(zhuǎn)1周，在取樣中應(yīng)避免觸及舌、口頰黏膜和唾液。采集后立即將咽拭子放入已制備好的2 ml格林氏液內(nèi)(內(nèi)置玻璃珠2個(gè))，充分混勻后進(jìn)行10倍系列稀釋(10-1～10-4)，取10-3～10-4濃度各100 ml分別接種于血平板、巧克力平板、麥康凱平板、沙保弱平板、厭氧血平板上，用無(wú)菌L棒均勻涂抹。其中血平板、麥康凱平板、沙保弱平板置于35～37 ℃普通溫箱培養(yǎng)24 h，巧克力平板置于35～37 ℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h，厭氧血平板置于35～37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)48～72 h。

1.3.2 菌落描述與計(jì)數(shù) 將上述培養(yǎng)的各個(gè)平板進(jìn)行菌落的分類(lèi)與描述；取菌落數(shù)在100～300個(gè)之間的濃度為計(jì)數(shù)濃度，以菌落的顏色、大小、凹凸、溶血、邊緣整齊及濕潤(rùn)度等進(jìn)行菌落的分類(lèi)描述與計(jì)數(shù)。細(xì)菌數(shù)以細(xì)菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值表示(lg10nX)。所有需氧菌的菌數(shù)之和表示為需氧菌密度；所有厭氧菌的菌數(shù)之和表示為厭氧菌密度。

1.3.3 分離培養(yǎng)、菌株純化及革蘭染色初步鑒定 將上述各平板中每種不同單個(gè)菌落做革蘭染色，同時(shí)進(jìn)行分段劃線，轉(zhuǎn)種于各自相應(yīng)的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同步驟1.2.1，轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基直至得到純種菌株。其中厭氧血平板得到的純種菌株，需做需氧條件下的對(duì)照培養(yǎng)，以區(qū)分專(zhuān)性厭氧菌及兼性厭氧菌。詳細(xì)記錄菌株鏡下染色反應(yīng)、形態(tài)、大小、排列及結(jié)構(gòu)特征等。

1.3.4 細(xì)菌的鑒定 根據(jù)菌株染色性質(zhì)及形態(tài)特征選擇法國(guó)生物梅里埃生化鑒定試劑條，按照說(shuō)明書(shū)制備菌懸液，加樣，培養(yǎng)，鑒定菌種名稱(chēng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 咽部菌群密度的比較 咽部菌群的定量分析比較結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 3組人群細(xì)菌的菌群密度比較

注：與健康組比較，1)P<0.05；2)P<0.01

表2 3組人群咽部菌群密度的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

2.2 呼吸道感染未治療及治療后患者咽部細(xì)菌檢出率的比較 細(xì)菌檢出率的比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 呼吸道感染未治療及治療后咽部主要細(xì)菌種類(lèi)的檢出率(%)

注：與健康組比較，1)P<0.05；2)P<0.01

3 討論

咽部正常菌群是機(jī)體天然防御屏障，可抵御外來(lái)有害因素的侵襲，當(dāng)機(jī)體受害或抵抗力下降時(shí)，菌群數(shù)量和種類(lèi)失衡，防御屏障被破壞，導(dǎo)致條件致病菌或外源性病原菌侵入而引起呼吸道感染。從表3可知，健康人群咽部需氧菌中，甲型鏈球菌、奈瑟球菌、表皮葡萄球菌的檢出率相對(duì)較高，檢出率分別達(dá)到了91.0%、70.0%、59.9%；微球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌亞種等的檢出率就相對(duì)較低。厭氧菌中，消化鏈球菌、韋榮球菌、類(lèi)桿菌的檢出率相對(duì)較高，分別為50.0%、30.0%、26.7%；乳桿菌、衣氏放線菌等的檢出率相對(duì)較低。

表1和表2的數(shù)據(jù)顯示，呼吸道感染未治療患者需氧菌密度與健康人群比較差異有顯著性(P<0.05)；未治療組患者厭氧菌的密度與健康組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)，以上說(shuō)明早期的呼吸道感染僅僅是呼吸道咽部菌群的輕度失調(diào)和紊亂，厭氧菌群的密度基本保持平衡。

而呼吸道感染經(jīng)5 d三代頭孢菌素治療后患者的需氧菌密度與健康組相比差異有顯著性(P<0.05)；同時(shí)，經(jīng)治療組患者厭氧菌密度與健康組相比，差異有顯著性(P<0.01)。由此可以看出，呼吸道感染經(jīng)三代頭孢菌素治療后所導(dǎo)致的呼吸道菌群紊亂和失調(diào)比感染早期更加嚴(yán)重。

從表3數(shù)據(jù)可知，健康機(jī)體、呼吸道感染未經(jīng)治療及經(jīng)5 d三代頭孢菌素治療后患者的咽部存在的需氧菌，主要以甲型鏈球菌檢出率最高，其次是奈瑟球菌和表皮葡萄球菌，這三類(lèi)菌在感染治療后數(shù)量減少較明顯，且治療后與未治療組患者相比差異有顯著性(P<0.01)。

呼吸道感染主要的條件致病菌以革蘭陰性菌為主，在此次研究中革蘭陰性菌感染占前5位的為熒光假單胞菌、大腸埃希菌、嗜麥芽窄食單胞菌、肺炎克雷伯菌亞種、鮑氏不動(dòng)桿菌；對(duì)于感染治療后患者呼吸道條件致病菌的檢出率與健康人群相比差異有顯著性(P<0.05)，說(shuō)明三代頭孢菌素的使用給條件致病菌提供了一定的繁殖機(jī)會(huì)，廣譜抗生素對(duì)條件致病菌具有一定的篩選作用[2-4]。實(shí)驗(yàn)表明以上五種呼吸道條件致病菌，其引起的感染主要與三代頭孢菌素的使用有關(guān)。

抗生素的治療對(duì)呼吸道的菌群數(shù)量和種類(lèi)有一定的影響，由于抗生素等外在因素的作用，呼吸道黏膜固有菌群的平衡被破壞，導(dǎo)致的菌群紊亂也預(yù)示著炎癥病理的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[5]，抗生素的長(zhǎng)期使用是呼吸道菌群紊亂難以糾正的根源[6]。經(jīng)治療后患者需氧菌及厭氧菌密度皆增高，同時(shí)導(dǎo)致呼吸道感染的致病菌和條件致病菌的檢出率明顯提高，如嗜麥芽窄食單胞菌和金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等。

綜上所述，對(duì)呼吸道感染的預(yù)防、治療是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，抗生素的治療使感

染得到了控制，但也由此導(dǎo)致了咽部菌群的數(shù)量失調(diào)和條件致病菌檢出率的增加。對(duì)于呼吸道感染從菌群平衡發(fā)展角度來(lái)看，保護(hù)呼吸道的正常菌群平衡，對(duì)感染的有效治療是必不可少的。要加強(qiáng)對(duì)菌群平衡的監(jiān)測(cè)，合理和謹(jǐn)慎地使用抗生素[7-8]。本研究為臨床在治療呼吸道感染時(shí)應(yīng)合理使用抗生素，在治療中要利用原籍菌的結(jié)構(gòu)屏障、生物拮抗功能來(lái)抑制致病菌和致病因子的作用，為恢復(fù)、保護(hù)和調(diào)整呼吸道內(nèi)部固有菌群的微生態(tài)平衡提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

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