摘要：提出了一種基于ZrO2iO2核殼型材料吸附磷脂的分析方法。首先利用N2O內(nèi)部水解法制備了含不同比例ZrO2包覆的ZrO2iO2核殼型顆粒并通過電鏡和紫外吸收漫反射圖譜對其進(jìn)行了表征，證明在iO2表面包覆有ZrO2材料。采用RPPLELReversedphasehighperformanceliquidchromatographyevaporativelightscatteringdetector以甲醇水（含醋酸銨）為流動相，優(yōu)化并建立了種磷脂的分析方法。在以上基礎(chǔ)上將ZrO2iO2核殼型材料制成固相萃取olidphaseextractionPE小柱，以種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象，用RPLEL方法評價了PE小柱吸附磷脂的效率。發(fā)現(xiàn)包覆有%和7%rO2的ZrO2iO2核殼型材料吸附磷脂的能力均強(qiáng)于單純的ZrO2材料，且%的ZrO2iO2核殼型材料吸附效果最好，并將其初步應(yīng)用于血清中磷脂的選擇性吸附，結(jié)果表明，通過PE富集后，能檢測到更多的磷脂類代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：磷脂；二氧化鋯；核殼；固相萃取；高效液相色譜

1引言

磷脂（PhospholipidsPLs）是含有磷酸的脂類，它為兩性分子，一端為親水的含磷酸基團(tuán)的極性頭基，另一端為疏水的含有兩條長脂肪酸鏈的非極性尾部。磷脂是生物體內(nèi)細(xì)胞膜的重要組成部分，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用，它也與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，可作為某些疾病的信號分子。磷脂分為兩大類：甘油磷酯類和鞘脂類，甘油磷脂又分為卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇等，所以磷脂的種類繁多。

基于磷脂結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，磷脂分析是一個挑戰(zhàn)。常用的有薄層色譜法（L）、核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（M）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GM）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LM）等技術(shù)。L法靈敏度和分辨率都較低，且易引起磷脂的氧化和分解；GM不適合于直接分析磷脂，因為磷脂沒有揮發(fā)性，需要經(jīng)水解、甲酯化等處理；1PNMR可利用磷原子1P來分析各種磷脂，但NMR法的靈敏度較低，僅限于磷脂酰膽堿等組織中含量較高的磷脂樣品的測定；M法，特別是電噴霧質(zhì)譜EIM是目前磷脂分析中應(yīng)用最多的軟電離法，EIM法前處理簡單，分析時間短，不足之處在于難以分析豐度較低的磷脂。在此基礎(chǔ)上，an等又開發(fā)了基于源內(nèi)分離的“鳥槍法和多維質(zhì)譜法測定磷脂和其他脂質(zhì)分子。PLEIM具有高分辨率、高靈敏度和特異性強(qiáng)等優(yōu)點，是磷脂分析的較好工具，但儀器價格昂貴。蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporativelightscatteringdetector，EL）作為一種新型通用型檢測器它價格便宜，且無L和GM分析磷脂的缺點，在分析過程中不易引起磷脂的氧化和分解，適合直接分析磷脂，在磷脂分析中具有很好的可行性。

在生物樣品中磷脂種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，低豐度檢測困難，且干擾較多。如果在應(yīng)用上述方法分析前，先對磷脂進(jìn)行選擇性提取，對于體內(nèi)的磷脂分析，特別是對發(fā)現(xiàn)一些微量的信號分子是很重要的。常用的磷脂提取方法有甲基叔丁基醚（Methyltertbutylether，ME）液液萃取法和固相萃取法（PE）。PE比較常用的是氨丙基、氨基或二醇基修飾的硅膠等正相材料，但這些方法選擇性普遍不高。

金屬氧化物（如ZrO2等）由于具有路易斯酸堿的特性，在酸性條件下可以與帶有磷酸基團(tuán)的物質(zhì)結(jié)合，達(dá)到與其它物質(zhì)分離的目的，在堿性條件下洗脫則可達(dá)到富集的目的，故金屬氧化物選擇性富集磷脂是非常有前景的方法，但ZrO2本身存在比表面積小，顆粒粒徑小，不適合做PE填料等缺點。本研究采用N2O內(nèi)部水解法，將ZrO2負(fù)載在球形硅膠微球之上，制成核殼型ZrO2iO2顆粒，并填充為PE小柱，用于選擇性富集磷脂，并采用RPLEL進(jìn)行評價。結(jié)果表明，本研究獲得的核殼型ZrO2iO2顆粒具有良好的富集效率，在生物樣品分析中有很好的應(yīng)用前景。

2實驗部分

21儀器與試劑

himadzuL2A高效液相色譜儀（日本島津公司）；ELUM蒸發(fā)光散射檢測器上海通微分析技術(shù)有限公司；X8A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；飛鴿牌GL16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；22電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；Molatom18a摩爾原子型超純水器（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）；8場發(fā)射掃描電子顯微鏡日本itachi公司Lambda9紫外可見近紅外分光光度計美國；8反相高效液相色譜柱2mm

ymbolt@ 6mm，μm，蘇州環(huán)球色譜有限公司；

溶血磷脂酰膽堿（1Palmitoyl2hydroxysnglycerophosphocholinelysoP16∶），溶血磷脂酰膽堿（1tearoyl2hydroxysnglycerophosphocholinelysoP18∶），磷脂酰膽堿12imyristoylsnglycerophosphocholineMP磷脂酰乙醇胺1Palmitory2oleoylsnglycerophosphoethanolaminePOPE磷脂酰膽堿（1Palmitory2oleoylsnglycerophosphocholinePOP）均購于美國AvantiPolarLipids公司；乙酸銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；2μm球形硅膠蘇州環(huán)球色譜公司；ZrOl2·82Ο（上海阿拉丁試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純，上海星可生化有限公司）；異丙醇、正己烷色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司；氯仿分析純，國藥試劑有限公司；氨水（分析純，平湖化學(xué)試劑廠）。

22實驗方法

221ZrO2iO2填料制備采用N2O內(nèi)部水解法＼[121＼]制備二氧化鋯包覆的二氧化硅核殼結(jié)構(gòu)填料。過程為：采用相當(dāng)于%ZrO2iO2，ww的ZrOl2·82O水溶液多次浸潤2μm球形硅膠，并在6℃不斷攪拌直至干燥；在1℃下干燥6h，將ZrOl2負(fù)載的iO2放置進(jìn)1%氨水環(huán)境中，在6℃下水浴約～6h，然后在℃馬弗爐內(nèi)煅燒數(shù)小時，即得到%（ZrO2iO2，ww）包覆的ZrO2iO2核殼型材料。7%ZrO2iO2（ww）核殼型材料制備方法與上相似。本實驗中所用ZrO2對照材料由ZrOl2·82O直接煅燒得到。

222固相萃取步驟將mgrO2iO2顆粒裝填在1mLPE小柱內(nèi)，PE小柱的頂部和底部分別放入聚丙烯篩板。取1μL磷脂標(biāo)準(zhǔn)品或者血漿磷脂提取物，溶解在μL含1%甲酸的正己烷異丙醇（2∶8VV）溶液內(nèi)，加入到ZrO2iO2填充的PE小柱中，平衡后回收流出液，記為流出液（Nobindingsolution）；用μL正己烷異丙醇（2∶8VV）溶液清洗PE小柱，回收清洗液，記為清洗液（ashingsolution）；分別用μL7molL氨水甲醇溶液洗脫，共次合并洗脫液，記為洗脫液（Elution）。

而對于ZrO2，上樣、清洗和洗脫步驟同上述PE方法相同。只是采用離心的方法，渦旋min靜置min1rmin離心min，取上清液。得到流出液、清洗液和洗脫液后，揮干，分別用1μL甲醇復(fù)溶，備用。