摘 要：為了研究不同溫度對(duì)小鼠成肌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響在IO玻璃芯片上加載電場(chǎng)形成一定的溫度分布在不同溫度（38、39、0和1℃）所對(duì)應(yīng)的區(qū)域加工相同尺寸的PM微型培養(yǎng)腔室用于小鼠成肌細(xì)胞的培養(yǎng)通過對(duì)芯片上培養(yǎng)的小鼠成肌細(xì)胞連續(xù)d的熱刺激（30min/d）研究不同溫度短期熱刺激對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞形態(tài)顯微觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明一定的溫度刺激對(duì)小鼠成肌細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用其中0℃刺激后的細(xì)胞數(shù)目增加最明顯在總刺激時(shí)間（30min）相同情況下短時(shí)多次熱刺激的效果更理想細(xì)胞增殖指數(shù)最高可達(dá)3839

關(guān)鍵詞：IO玻璃；成肌細(xì)胞；熱刺激；細(xì)胞周期；細(xì)胞增殖

013011收稿；01301接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（Nos81071783107088）教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”（NoNCE0908）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)“研究生科技創(chuàng)新基金”項(xiàng)目（NoCX113006）資助

1 引 言

溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系密切一直是細(xì)胞體外培養(yǎng)研究中的熱點(diǎn)細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度一般為37～38℃溫度過高或過低都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)將乳腺癌腫瘤細(xì)胞系MAM31在37～℃進(jìn)行培養(yǎng)觀察表明溫度的變化會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)改變細(xì)胞骨架從而改變細(xì)胞生長(zhǎng)狀況或者引起細(xì)胞死亡＼1＼另一些實(shí)驗(yàn)則證實(shí)較低的溫度可以促進(jìn)某些細(xì)胞對(duì)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)＼＼

細(xì)胞溫度特性的研究促進(jìn)了其在臨床應(yīng)用中的快速發(fā)展＼3＼目前熱物理治療已成為發(fā)展最快的臨床醫(yī)學(xué)物理學(xué)方法之一它常作為一種簡(jiǎn)單、有效的治療方式廣泛用于肌肉損傷修復(fù)中＼＼熱物理治療所引起的肌肉細(xì)胞的變化機(jī)制目前仍不是十分明確熱刺激對(duì)成肌細(xì)胞（keletalmyoblast）生長(zhǎng)狀態(tài)的影響可能是其中的一個(gè)重要途徑＼＼成肌細(xì)胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細(xì)胞來源于中胚層干細(xì)胞胚胎發(fā)育都經(jīng)歷了由間充質(zhì)細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞然后分裂、融合成為多核肌纖維形成肌小管再進(jìn)一步分化為成熟肌細(xì)胞的過程在成熟個(gè)體中不含成肌細(xì)胞而是以處于靜止?fàn)顟B(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞的形式存在該衛(wèi)星細(xì)胞位于肌纖維基底膜與肌膜之間當(dāng)肌肉發(fā)生損傷時(shí)衛(wèi)星細(xì)胞就會(huì)被激活大量增殖、融合并分化產(chǎn)生新生肌纖維＼6＼在臨床和基礎(chǔ)研究中通過成肌細(xì)胞自我更新和促進(jìn)肌纖維再生可治療各種肌肉拉傷、損傷、凍傷和肌肉丟失性疾病所以成肌細(xì)胞的增殖速度、融合率的高低直接影響疾病治療的效果在熱物理治療中合適的熱刺激強(qiáng)度對(duì)成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖至關(guān)重要體外培養(yǎng)成肌細(xì)胞并觀察不同溫度對(duì)其增殖的影響對(duì)指導(dǎo)肌肉損傷的熱物理治療有積極意義

目前關(guān)于細(xì)胞溫度特性的研究常采用細(xì)胞培養(yǎng)器皿整體加熱的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞易污染每次只能進(jìn)行單一溫度的測(cè)試分析＼7＼而且實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、細(xì)胞和試劑消耗大實(shí)驗(yàn)觀察不方便微加工和微流控技術(shù)的發(fā)展特別是微全分析系統(tǒng)概念的提出＼8＼開創(chuàng)了細(xì)胞芯片這一新的研究領(lǐng)域而基于IO玻璃的微芯片在溫度控制、實(shí)驗(yàn)操作和觀察方面具有突出優(yōu)點(diǎn)＼9＼因此本研究利用IO玻璃作為加熱源和細(xì)胞培養(yǎng)芯片的基底考察溫度短期熱刺激對(duì)成肌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響本方法可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的溫度控制成肌細(xì)胞的熱刺激響應(yīng)測(cè)試結(jié)果與傳統(tǒng)水浴方法一致而且在同一芯片上可以同時(shí)研究多個(gè)溫度、溫度刺激模式甚至一定溫度梯度對(duì)細(xì)胞的影響與傳統(tǒng)方法相比本方法操作簡(jiǎn)單、效率更高、試劑消耗少、便于觀察分析

實(shí)驗(yàn)部分

1 儀器與試劑

CO細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)orma公司）超凈工作臺(tái)（中國(guó)冠鵬凈化公司）倒置顯微鏡、數(shù)碼照相機(jī)（日本Olympus公司）臺(tái)式離心機(jī)（日本ubota公司）流式細(xì)胞儀（美國(guó)ectonickinson公司）恒流源（上海實(shí)博教儀公司）等離子清洗儀（中國(guó)恒業(yè)電子公司）紅外測(cè)溫儀（中國(guó)華盛昌公司）IO單面導(dǎo)電玻璃（龍乾玻璃廠）

成肌細(xì)胞培養(yǎng)基包含78%am10動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)yclone公司）0%胎牛血清（etalcalfserum美國(guó)yclone公司）；胰蛋白酶（北京翰譜公司）；1%NaCO3、1%青鏈霉素、Ⅰ型膠原蛋白（上海碧云天公司）；聚二甲基硅氧烷（PolydimethylsiloxanePM美國(guó)owCorning公司）；P緩沖液（匯林試劑公司）

芯片加工 由于PM具有很強(qiáng)的通氣性和可塑性可用來制作微型培養(yǎng)腔室＼1011＼：首先將PM單體與固化劑按10∶1均勻混合脫氣除去氣泡后均勻澆注在水平放置的模板框槽中80℃固化1h后再?gòu)哪０迳先∠?/p>

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)微芯片

ig1 Microchipforcellculture

IO：Indiumtinoxide；PM：polydimethylsiloxane

形成一個(gè)與IO玻璃等邊長(zhǎng)的厚度為0cm的膠塊即邊長(zhǎng)為cm×cm×0cm；根據(jù)仿真及測(cè)量結(jié)果在玻璃表面不同溫度分布區(qū)域選定相應(yīng)培養(yǎng)腔室（直徑為8mm）位置用打孔器將PM膠塊相對(duì)應(yīng)的區(qū)域挖空；利用等離子清洗儀將PM和IO玻璃的不導(dǎo)電面進(jìn)行鍵合；用導(dǎo)電膠將銅電極固定在IO玻璃導(dǎo)電面即得到實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞培養(yǎng)芯片（圖1）

3 實(shí)驗(yàn)過程

31 細(xì)胞培養(yǎng)芯片的包被

小鼠成肌細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)前需要對(duì)培養(yǎng)芯片進(jìn)行膠原蛋白包被使細(xì)胞更容易貼壁生長(zhǎng)培養(yǎng)芯片經(jīng)高溫高壓滅菌處理后在超凈臺(tái)上進(jìn)行包被操作向各培養(yǎng)腔室中加入適量的膠原蛋白溶液0min后吸出溶液；放置1h后加入P緩沖液清洗對(duì)培養(yǎng)腔室中的膠原蛋白進(jìn)行堿性去除；～6min后吸出P同樣步驟重復(fù)兩次最后放置8h封裝后放入冰箱℃儲(chǔ)藏備用

3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠選取第三代細(xì)胞胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×10/mL均勻接種于各培養(yǎng)腔室中在37℃%CO條件下預(yù)培養(yǎng)h 分析化學(xué)第1卷

第8期張曉娟等：IO玻璃芯片上溫度分布對(duì)成肌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

33 溫度刺激 玻璃培養(yǎng)芯片加載7V的穩(wěn)定電壓即可得到所需的刺激溫度分布每天刺激30min更換新鮮培養(yǎng)液以避免溫度升高引起的水分與營(yíng)養(yǎng)的丟失然后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)連續(xù)刺激d整個(gè)過程在完全無(wú)菌條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)采用兩種溫度刺激模式一是連續(xù)刺激30min二是短時(shí)多次刺激總刺激時(shí)間30min

3 細(xì)胞收集及流式細(xì)胞儀分析

連續(xù)刺激d后收集細(xì)胞固存用于流式細(xì)胞儀分析采用兩步消化法消化貼壁的成肌細(xì)胞：（1）加入P緩沖液清洗中和殘余的培養(yǎng)液有利于增強(qiáng)下一步胰酶蛋白酶的消化作用；（）在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化1min鏡下細(xì)胞基本上都從壁上脫落加入培養(yǎng)液終止消化細(xì)胞懸液放入離心管離心去掉廢液后加入P緩沖液將離心的細(xì)胞吹散清洗再次離心去掉P緩沖液清洗兩次的細(xì)胞加入到1～mL70%～7%的酒精中固存h后即可進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)

3 結(jié)果與討論

31 仿真分析

采用IO玻璃作為加熱源一方面是因?yàn)镮O玻璃的表面溫度隨施加的電壓不同而改變便于精確控制；另一方面在IO玻璃上加載一定電壓后由于電流量的區(qū)別可以形成不同溫度區(qū)域以及特定的溫度梯度分布同時(shí)細(xì)胞可以直接培養(yǎng)在IO玻璃上不僅避免了溫度由加熱源到培養(yǎng)器皿之間傳遞的時(shí)間延擱和由此產(chǎn)生的誤差而且在單一玻璃培養(yǎng)芯片上就能實(shí)現(xiàn)多種熱刺激模式大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作提高實(shí)驗(yàn)效率避免污染

IO薄膜在可見光范圍透射率極高可達(dá)9%以上不會(huì)影響顯微鏡對(duì)細(xì)胞的觀察＼1＼本研究選用邊長(zhǎng)為cm、厚度為11mm、電阻為100Ω的單面導(dǎo)電IO玻璃在電極上加載一定電壓后IO玻璃的薄膜電阻導(dǎo)電發(fā)熱使玻璃表面溫度升高由于加載電極的位置與長(zhǎng)度不同溫度分布有很大的差異為了選擇適宜細(xì)胞溫度特性研究的溫度分布需要對(duì)加電后玻璃表面的溫度分布情況進(jìn)行仿真分析仿真采用ComsolMultiphysics3a軟件（美國(guó)Comsol公司）所運(yùn)用的偏微分方程1～電加熱方程：