摘 要：以多克隆抗體包被磁性微球制備捕獲探針，以表面負(fù)載大量三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記物的噬菌體展示抗體為發(fā)光探針有效放大信號(hào)，成功建立了相思子毒素電化學(xué)發(fā)光免疫傳感檢測方法。利用本方法檢測相思子毒素，濃度在0.005～100 μg/L范圍內(nèi)與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的對數(shù)線性關(guān)系，擬合方程為lgY=0.701lgX+1.767（R=0.9964，N=7，p<0.0001），檢測限達(dá)0.005 μg/L（S/N=3）。與采用單克隆抗體制備標(biāo)記探針相比，檢測靈敏度提高20倍，可用于相思子毒素的痕量檢測。

關(guān)鍵詞：噬菌體展示抗體； 相思子毒素； 電化學(xué)發(fā)光； 免疫傳感器

1 引 言

電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）免疫傳感器檢測蛋白類生物大分子多是以傳感器表面固定抗體為捕獲探針，以發(fā)光標(biāo)記物如聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）2+3]標(biāo)記抗體為發(fā)光探針，在靶標(biāo)存在的情況下，形成“捕獲探針-靶標(biāo)-發(fā)光探針”復(fù)合物，在電極表面發(fā)生ECL反應(yīng)，以此測定靶標(biāo)濃度^[1～5]?？贵w活性以及標(biāo)記物的量將直接影響檢測的靈敏度。對于傳統(tǒng)抗體，分子表面可供標(biāo)記的基團(tuán)有限，而且多位點(diǎn)標(biāo)記也可能影響其結(jié)合活性，這限制了靈敏度的進(jìn)一步提高。

噬菌體展示抗體是通過噬菌體展示技術(shù)獲得的一種可溶性抗體片段或是表面展示有抗體片段的噬菌體^[6]，對于后者，其表面除了展示的抗體片段外就是大量的衣殼蛋白。以展示有單鏈抗體（Single chain variable fragments，scFv）的M13噬菌體為例，M13為絲狀，長約900 nm，寬約8 nm，衣殼約由2800拷貝的5 kDa的主要衣殼蛋白pⅧ組成^[7]，scFv融合表達(dá)在位于一端的約5拷貝的次要衣殼蛋白pⅢ中的1個(gè)拷貝上。若進(jìn)行標(biāo)記，會(huì)有更多的標(biāo)記物連接在數(shù)量龐大的衣殼蛋白上^[8]，展示抗體僅僅是“躲在”一端的一個(gè)小角落里，從而被標(biāo)記上較少的標(biāo)記物，可最大限度避免多位點(diǎn)標(biāo)記造成的活性降低或消失。因此，噬菌體展示抗體做標(biāo)記探針能大大增加標(biāo)記物數(shù)量，而又最小程度影響結(jié)合活性，從而起到放大信號(hào)作用。

本研究以劇毒生物毒素相思子毒素（Abrin）為檢測目標(biāo)，以Abrin多克隆抗體（多抗）包被的磁微球?yàn)椴东@探針，以Ru（bpy）2+3標(biāo)記的Abrin噬菌體展示抗體為發(fā)光探針，將磁性微球分離富集與噬菌體展示抗體大量負(fù)載發(fā)光標(biāo)記物放大ECL信號(hào)相結(jié)合，建立了一種檢測Abrin的新方法，有效放大了檢測信號(hào)，提高了檢測靈敏度。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

磁免疫電化學(xué)發(fā)光傳感檢測平臺(tái)（本實(shí)驗(yàn)室與西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司聯(lián)合研制），MPI-E型電化學(xué)發(fā)光檢測儀（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）；BIOMATE 3S紫外可見分光光度計(jì)（美國賽默飛世爾科技）；HS-3垂直混合器（寧波新芝生物科技股份有限責(zé)任公司）；磁分離架（美國Promega公司）。

三聯(lián)吡啶釕N-羥基琥珀酰亞胺酯（Ru（bpy）2+3-NHS ester，美國Sigma公司），活化生物素（Biotin-NHS ester，美國Sigma公司）；鏈親和素包被磁微球（New England BioLabs公司，直徑2.0 μm），Abrin、Abrin多抗、Abrin單抗、Abrin噬菌體展示抗體、蓖麻毒素（Ricin）、葡萄球菌腸毒素B（SEB，本實(shí)驗(yàn)室）；發(fā)光檢測液與CleanCell清洗液（北京百隆騰科技發(fā)展有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，上海國藥集團(tuán)有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）用0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl配制而成；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，其它所用化學(xué)品和試劑均為分析純。

2.2.2 捕獲探針制備 （1）Abrin多抗生物素化 用1 mL DMSO 溶解活化生物素1 mg，向1 mL Abrin多抗溶液（1 mg/mL）中加入120 μL 活化生物素溶液（即含活化生物素 120 μg）；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2～4 h；加入9.6 μL 1 mol/L NH4Cl（每25 μg 活化生物素加1 μL），在室溫下攪拌10 min；超濾除去未結(jié)合的活化生物素，以PBS重懸至1 mL。（2）磁微球捕獲探針構(gòu)建 將生物素化的abrin多抗 20 μL加入1 mL（1 g/L）親和素包被的磁微球中，室溫振蕩孵育1 h，置于磁分離架上用PBST（含0.15% Tween-20的PBS）清洗兩次，PBS清洗兩次除去未結(jié)合的Abrin多抗，余下結(jié)合了Abrin多抗的磁微球，加PBS重懸至1 mL， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 ECL檢測 將Abrin多抗包被的磁微球50 μL與50 μL樣品混合， 室溫振蕩孵育15 min，置于磁分離架上用PBS清洗兩次，再加入50μL 標(biāo)記探針混合后室溫振蕩孵育1 h，結(jié)合磁分離用PBS清洗兩次，用發(fā)光檢測液重懸后加入檢測池，磁微球復(fù)合物磁鐵作用下沉積在工作電極表面，在給定工作電極與參比電極之間恒定電壓1.4 V下，標(biāo)記在噬菌體上的Ru（bpy）2+3就和發(fā)光檢測液中的三丙胺（TPA）發(fā)生ECL反應(yīng)，光信號(hào)由光電倍增管（PMT）檢測。整個(gè)檢測過程如圖1所示。ECL反應(yīng)結(jié)束后，將磁鐵位置移至離電極最遠(yuǎn)處，先用去離子水、CleanCell清洗液結(jié)合電化學(xué)階躍脈沖清洗檢測池與電極，再用去離子水和ProCell發(fā)光檢測液沖洗，直至ECL值恢復(fù)至基線水平（空白信號(hào)）后進(jìn)行下一輪檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)光探針性質(zhì)

3.1.1 發(fā)光探針紫外-可見光譜 如圖2所示，Abrin噬菌體展示抗體經(jīng)標(biāo)記后其紫外-可見光譜發(fā)生改變，a為abrin噬菌體展示抗體光譜圖，在269 nm處有一個(gè)特征吸收峰，因?yàn)槭删w顆粒為衣殼蛋白內(nèi)包裹著核酸，269 nm處反映的是DNA的吸收峰；b為標(biāo)記物Ru（bpy）2+3-NHS ester的圖譜，聯(lián)吡啶釕在220～600 nm之間有3個(gè)特征吸收峰，其中可見光457 nm處的吸收對應(yīng)于金屬Ru到bpy配體dπ→π*電荷躍遷， 紫外區(qū)287 nm處的吸收是以配體為中心的π→π*躍遷，紫外區(qū)的另一個(gè)吸收峰在245 nm處，也是金屬Ru到bpy配體的dπ→π*電荷躍遷^[11]； c為Ru（bpy）2+3標(biāo)記Abrin噬菌體展示抗體的光譜圖，位于285 nm吸收峰應(yīng)對應(yīng)于聯(lián)吡啶釕287 nm的吸收峰，254 nm處吸收應(yīng)對應(yīng)于聯(lián)吡啶釕245 nm處的吸收，稍紅移，457 nm處為聯(lián)吡啶釕的特征吸收，這表明Ru（bpy）2+3-NHS ester已經(jīng)標(biāo)記到噬菌體展示抗體上。

3.2 孵育時(shí)間的確定

因Abrin單鏈抗體展示于M13噬菌體表面，且M13較大，且為長絲狀，其運(yùn)動(dòng)相對抗體來說非常緩慢，又因scFv位于一端，這降低了M13與Abrin接觸的幾率，有必要對孵育時(shí)間進(jìn)行考察。Abrin濃度為50 μg/L時(shí)，在加入Ru（bpy）2+3標(biāo)記的Abrin噬菌體展示抗體后分別孵育10， 20， 30， 40， 50， 60， 70和80 min，隨孵育時(shí)間增加，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化見圖4。孵育時(shí)間小于60 min時(shí)，隨孵育時(shí)間增加發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；孵育時(shí)間大于60 min時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)。說明室溫下的M13參與的結(jié)合反應(yīng)在60 min后基本達(dá)到飽和。因此，加入標(biāo)記探針后孵育時(shí)間定位 60 min。

4 結(jié) 論

利用展示有Abrin單鏈抗體的M13噬菌體作為載體構(gòu)建發(fā)光標(biāo)記探針，在M13噬菌體表面固載大量的三聯(lián)吡啶釕信號(hào)分子，有效放大了發(fā)光信號(hào)，成功建立了高靈敏、高特異性的夾心式新型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感檢測方法。本方法較使用單抗作標(biāo)記探針在靈敏度上提高20倍，又由于噬菌體展示抗體相對傳統(tǒng)抗體的高度穩(wěn)定性，可依此為基礎(chǔ)發(fā)展生物毒素的現(xiàn)場痕量檢測方法以及開發(fā)性能穩(wěn)定的試劑盒。