摘 要：運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究了Wistar大鼠灌胃給藥砒霜2和10 mg/kg劑量血清代謝的變化。通過(guò)核磁共振技術(shù)檢測(cè)大鼠血清的代謝指紋圖譜，然后利用主成分分析法分析空白組和砒霜給藥組的代謝物差異，研究不同劑量砒霜在大鼠體內(nèi)的急性生物效應(yīng)。結(jié)果表明，砒霜對(duì)大鼠的急性靶向器官是肝臟，隨著劑量增大，毒性增強(qiáng)；低劑量給藥導(dǎo)致氧化應(yīng)激，高劑量給藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；低和高劑量給藥均出現(xiàn)糖、氨基酸及脂質(zhì)代謝紊亂，且能量代謝異常。

關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)； 砒霜； 核磁共振； 血清； 主成分分析

1 引 言

1999年，Nicholson等提出代謝組學(xué)（Metabonomics）的概念，并將其定義為：對(duì)生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致動(dòng)態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定量測(cè)定^[1]。如今，代謝組學(xué)已應(yīng)用于疾病診斷、藥物毒性、營(yíng)養(yǎng)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域^[2～5]。代謝組學(xué)方法主要利用現(xiàn)代分析技術(shù)如GC-MS， LC-MS， HR MAS和1H NMR等，結(jié)合模式識(shí)別方法，對(duì)生物體液和組織進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)和分析，從而得到生物體代謝物濃度隨時(shí)間變化的信息^[6，7]。

砒霜為臨床上應(yīng)用廣泛的礦物藥，主要成分是As2O3及一些礦物質(zhì)，主要用于治療寒痰哮喘、瘧疾、梅毒和痔瘡等疾病。但研究表明，砒霜既能治療急性早幼粒細(xì)胞白血病^[8]，又能誘導(dǎo)體內(nèi)外的腫瘤細(xì)胞株凋亡^[9，10]；同時(shí)，As2O3是一個(gè)活性很高的分子，能與很多蛋白的巰基結(jié)合，對(duì)線粒體產(chǎn)生毒性作用，消除細(xì)胞膜電位，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（Reactive oxygen species， ROS）^[11]。砒霜進(jìn)入人體后能破壞某些細(xì)胞呼吸酶，強(qiáng)烈刺激胃腸粘膜、破壞肝臟，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致呼吸和循環(huán)衰竭。As被認(rèn)為是毒性物質(zhì)和致癌物，但對(duì)其毒性評(píng)價(jià)還不完全。主成分分析是毒性評(píng)價(jià)中常用的模式識(shí)別方法之一，利用它對(duì)體液1H NMR譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，能得到有價(jià)值的生物信息。本研究利用主成分分析法和基于1H NMR 的代謝組學(xué)方法^[12]，從分子水平對(duì)砒霜毒性和毒性作用機(jī)制進(jìn)行研究。

3 結(jié)果與討論

3.1 血清的1H NMR譜圖及多元統(tǒng)計(jì)分析

血清的組成均一性高，幾乎含有血液中所有的小分子化合物，通過(guò)CPMG序列得到的譜圖，可以減弱生物大分子產(chǎn)生的譜線變寬的干擾，進(jìn)而更好地研究血清中代謝物濃度變化過(guò)程。圖1為砒霜2和10 mg/kg劑量給藥48 h后及對(duì)照樣本血清的1H NMR譜圖譜峰，參考文獻(xiàn)[13，14]進(jìn)行譜峰歸屬。

低劑量破壞了大鼠的能量代謝，葡萄糖能夠快速補(bǔ)充能量，葡萄糖升高說(shuō)明砒霜抑制了機(jī)體能量代謝，肌酸與磷酸結(jié)合生成磷酸肌酸，迅速補(bǔ)充ATP在血液中的含量，血清中較低濃度的肌酸，說(shuō)明肌肉能量代謝過(guò)程可能受到抑制。低劑量的葡萄糖升高也與葡萄糖有氧糖代謝受阻有關(guān)。丙酮酸可通過(guò)糖異生作用生成葡萄糖，也可由糖酵解途徑生成，丙酮酸升高與糖代謝異常相關(guān)。低劑量氨基酸代謝紊亂，谷氨酰胺（Gln）是體內(nèi)含量最豐富的非必需氨基酸，約占體內(nèi)總游離氨基酸的50%，Gln的變化直接影響機(jī)體總氨基酸的代謝，N-乙?；堑鞍住惲涟彼岷捅彼釢舛鹊淖兓?，同樣反映了氨基酸代謝紊亂。砒霜中的砷為一種細(xì)胞原漿毒，進(jìn)入機(jī)體后與細(xì)胞酶系統(tǒng)中的巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的巰基化合物，本研究出現(xiàn)了糖及氨基酸代謝發(fā)生紊亂，可能與糖和氨基酸代謝的酶系統(tǒng)破壞有關(guān)。

3.2.2 高劑量組給藥代謝學(xué)分析 通過(guò)圖3可以找出高劑量給藥后48 h的生物標(biāo)記物：濃度升高的代謝物有LDL、 VLDL、NAC2、脂質(zhì)、不飽和脂質(zhì)；濃度降低的代謝物有纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、乙酸、NAC1、丙酮酸、谷氨酰胺、肌酸、膽堿、TMAO、甘油磷脂酰膽堿、葡萄糖、乳酸。

高劑量砒霜給藥48和96 h后，在大鼠血清1H NMR譜中均觀察到脂類及脂蛋白信號(hào)增強(qiáng)，這與脂代謝異常有關(guān)。Wei等^[18]研究雄黃 （As4S4） 給藥后大鼠血清的1H NMR譜時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂類及脂蛋白信號(hào)峰增強(qiáng)，說(shuō)明雄黃會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)也出現(xiàn)了脂類及脂蛋白信號(hào)峰增強(qiáng)現(xiàn)象，表明高劑量砒霜同樣會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與As2O3主要是通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化和促使其凋亡而發(fā)揮治療作用^[19]相同。

膽堿是體內(nèi)重要的甲基供體，無(wú)機(jī)砷進(jìn)入大多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，其代謝過(guò)程涉及一系列甲基化反應(yīng)。通過(guò)S-腺苷蛋氨酸（S-Adenosglmethiomine， SAM）提供甲基官能團(tuán)給砷，生成胂酸和二甲胂酸，并隨尿排出體外，此過(guò)程是砷的主要代謝途徑^{[20，21]}。本研究中高劑量組血清中膽堿降低，說(shuō)明了高劑量砷在血清中發(fā)生了甲基化反應(yīng)。

高劑量組中還觀察到葡萄糖及氨基酸（丙氨酸、谷氨酰胺）代謝紊亂，表明As（Ⅲ）進(jìn)入機(jī)體后與細(xì)胞酶系統(tǒng)中的巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的巰基化合物。

肝臟具有代謝功能，糖、氨基酸及脂的代謝過(guò)程與其相關(guān)。本研究的低、高劑量組均發(fā)生肝臟代謝功能異常，對(duì)肝臟造成損傷。TMAO降低是肝臟受損的標(biāo)志，在高劑量組中TMAO濃度變化，在低劑量組中濃度未發(fā)生變化，表明高劑量給藥組比低劑量給藥組對(duì)肝臟的損傷更嚴(yán)重。

乙酸是短鏈脂肪酸氧化的一個(gè)產(chǎn)物：乙酰乙酸+乙酰輔酶A→乙酰乙酰輔酶A+乙酸，高劑量血清中的乙酸濃度降低表明肝臟線粒體中進(jìn)行的脂代謝發(fā)生紊亂，但是在低劑量組中肝臟線粒體的脂肪代謝未出現(xiàn)異常。

1927年，Warburg等^[22]發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的能量代謝異常，即在有氧環(huán)境下，癌細(xì)胞優(yōu)先進(jìn)行糖酵解，并產(chǎn)生大量的乳酸，稱之為“有氧糖酵解”，亦稱為“Warburg效應(yīng)”，被認(rèn)為是癌細(xì)胞所具有的普遍特征。本研究觀察到乳酸濃度升高，是否與砒霜致癌有關(guān)，需要進(jìn)一步研究，但低、高劑量砒霜均造成能量代謝異常。

本研究表明，低劑量給藥導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制，而高劑量給藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高劑量給藥對(duì)大鼠造成的肝臟損傷較低劑量嚴(yán)重，低、高劑量給藥后均出現(xiàn)糖、氨基酸、脂代謝及能量代謝異常。低、高劑量給藥48 h后對(duì)大鼠造成的毒性達(dá)到最大，給藥168 h后對(duì)大鼠毒性作用恢復(fù)至給藥前，表明低、高劑量砒霜給藥的急性毒性作用是可恢復(fù)的，為砒霜的合理利用提供依據(jù)。