摘 要：建立了液相色譜-質(zhì)譜檢測血清中氫化可的松含量的方法。血清加內(nèi)標(biāo)后平衡30 min，加乙腈除蛋白，將混合液超聲10 min，再以3000 r/min離心15 min，取出上清液用氮?dú)獯蹈桑盟畯?fù)溶后，以相同體積乙酸乙酯萃取兩次，將兩次萃取的乙酸乙酯合并，氮?dú)獯蹈桑缓笥?00 μL流動相復(fù)溶，液相分離采用Zorbax Eclipse Plus C18 色譜柱，流動相為甲醇和含0.1%甲酸的水溶液（43∶57， V/V），日間和日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.3%～0.7%和0.3%～0.6%，回收率為99.6%～101.0%，定量限為1.68 μg/kg。運(yùn)用本方法檢測了3種人體血清中氫化可的松含量，并研究了血清中氫化可的松的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：氫化可的松； 同位素稀釋； 液相色譜-質(zhì)譜； 超聲萃?。?血清

1 引 言

氫化可的松是一種重要的腎上腺皮質(zhì)激素^[1]，在體液循環(huán)中大部分與蛋白質(zhì)鍵合。其主要參與碳水化合物代謝，具有阻礙周圍組織中蛋白質(zhì)合成和促進(jìn)免疫力的功能^[2]，同時參與控制人體新陳代謝速率和個體生長。異常的氫化可的松含量會導(dǎo)致多種疾病，比如阿狄森氏病、庫氏綜合癥和糖尿病等^[3]。因此準(zhǔn)確測量血清中氫化可的松含量對于監(jiān)測甾體激素的產(chǎn)生過程和人體健康有重要意義。

關(guān)于血清中氫化可的松檢測的方法很多，早期主要采用免疫分析法^[4，5]，但測量結(jié)果假陽性偏多^[6]。近年，大量關(guān)于使用液相色譜（LC）^[7～9]，氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）^[10，11]和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）^[12，13]的分析方法多有報道。多運(yùn)用固相萃?。⊿PE）去除蛋白，分離血清中目標(biāo)物，取得了一定的效果，但是這些方法往往前處理時間較長，實驗消耗昂貴，而且需要較高的實驗技巧。為了解決這些缺點，本研究采用超聲結(jié)合乙酸乙酯液液萃取的方法分離血清中氫化可的松。超聲波是一種特殊形式的能量，其在溶液中產(chǎn)生的沖擊波和微熱流能顯著增加待分析物的活性，多用于藥物分析，但用于血清中激素的分析還未見報道。同位素稀釋質(zhì)譜法是指將目標(biāo)物的同位素標(biāo)記加入待測樣品中，與目標(biāo)物充分混合，通過加入的標(biāo)記的量及質(zhì)譜檢測的目標(biāo)物及其同位素標(biāo)記的豐度比來計算目標(biāo)物含量的方法。在目標(biāo)物與其同位素標(biāo)記達(dá)到平衡后，同位素的豐度比既已恒定，混合后的樣品在進(jìn)行元素分離、濃縮、轉(zhuǎn)移、萃取等操作過程中，即使發(fā)生丟失，也不會改變同位素組成，避免了由此帶來的測量誤差。本實驗表明，超聲萃取可增加氫化可的松從蛋白和血清中分離效果，使用超聲波結(jié)合液液萃取，大大降低了實驗消耗，縮短了前處理時間，經(jīng)過同位素稀釋，進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜分析，方法準(zhǔn)確可靠。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

6410三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；Mill-Q Academic純水處理系統(tǒng)（法國Milli Pore公司）；CP324S電子天平（德國Sartorius 公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；Touch Mixer MT-51渦旋振蕩器（日本Yamato公司）；Branson 5510超聲波清洗機(jī)（美國Branson 公司）。

2.2 液相色譜條件及質(zhì)譜條件

2.2.1 液相色譜條件 安捷倫1200高效液相色譜儀，Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d.， 3.5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸溶液，兩相比例為43∶57；柱溫：25 ℃；樣品盤溫度：4 ℃；流速為0.25 mL/min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 安捷倫6410三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，ESI源，正離子模式。其它質(zhì)譜參數(shù)：干燥氣流速12 L/min、噴霧電壓413.7 kPa、毛細(xì)管電壓3500 V、碰撞能10 V、碎裂電壓130 V。整個質(zhì)譜檢測時間6 min，溶劑延遲1 min。

2.3 實驗方法

2.3.2 血清樣品的處理 將200μL血清加入1 mL安培瓶內(nèi)，并稱量血清質(zhì)量，加入適量的氫化可的松同位素標(biāo)記的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，并稱量其質(zhì)量。加標(biāo)血清在常溫下平衡30 min后，加入400 μL乙腈除蛋白，將混合液在超聲機(jī)上超聲10 min，再以3000 r/min離心15 min，取出上清液在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑?00 μL水復(fù)溶后，以相同體積乙酸乙酯萃取兩次，將兩次萃取液合并，在40 ℃下氮?dú)獯蹈?。然后?00 μL流動相復(fù)溶，充分渦旋以保證完全溶解。所有復(fù)溶液在用LC-MS/MS分析前都要經(jīng)過0.22 μm 濾膜過濾，分析進(jìn)樣量為10 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取條件的優(yōu)化本實驗中，對平衡時間和超聲時間進(jìn)行了優(yōu)化。如圖1所示，最優(yōu)平衡時間為30 min，最優(yōu)超聲時間為10 min。實驗還發(fā)現(xiàn)，吹干的血清在用乙酸乙酯萃取前，先用水復(fù)溶，可以有效除去很多水溶性雜質(zhì)。當(dāng)用乙酸乙酯萃取兩次后，氫化可的松基本萃取完全。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

注入10 μL 100.5 μg/kg氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜條件的優(yōu)化。全掃描模式下，用ESI源在正離子和負(fù)離子模式分別進(jìn)行掃描，以確定分子離子峰和合適的電離方式。結(jié)果表明，正離子模式下有更好的離子響應(yīng)，這可能是氫化可的松化學(xué)結(jié)構(gòu)中由于含有2個酮基和3個羥基，易于吸收質(zhì)子形成穩(wěn)定的[M+H]+ 準(zhǔn)分子離子，所以選擇正離子模式，采用ESI源。全掃描模式下確定了氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)記的母離子，在選擇離子檢測模式下以氮?dú)鉃榕鲎矚怏w，對母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（CID），確定響應(yīng)最高的子離子。在確定了母離子和子離子的條件下，采用LC-MS/MS的選擇離子檢測模式（MRM）進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，對碰撞能（Fragmentor）和碎裂電壓（CE）分別進(jìn)行優(yōu)化，以保證得到的子離子有最大離子響應(yīng)。圖2和圖3是實驗所得全掃描質(zhì)譜圖和MRM模式下子離子質(zhì)譜圖，通過圖2可以得到氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)的母離子為m/z 363.20，標(biāo)記的母離子為m/z 367.20，圖3顯示出氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)記豐度最大的子離子分別是m/z 327.2和331.2，由兩圖確定了MRM模式下氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)的離子對為： m/z 363.20/327.2， 氫化可的松標(biāo)記的離子對為m/z 367.20/331.2，圖4是血清樣品中氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖。由圖4可見，優(yōu)化質(zhì)譜條件可以大大提高質(zhì)譜對氫化可的松的響應(yīng)，色譜圖顯示沒有相似物峰干擾定量分析，說明前處理條件較合適。

3.3 方法確證實驗

為了評估本方法的準(zhǔn)確性，實驗選取由美國NIST提供的CCQM-K63a比對樣品作為質(zhì)控樣品。有關(guān)CCQM-K63a結(jié)果本實驗室已有報道^[14]，但是當(dāng)時所用的方法需要對血清磷酸化和過SPE柱，本實驗采用超聲結(jié)合乙酸乙酯液液萃取的方法，提高了實驗效率，減少前處理時間，節(jié)約了成本，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，不確定度大大降低。實驗結(jié)果如圖5所示。其中，韓國標(biāo)準(zhǔn)研究所（KRISS）、英國政府化學(xué)實驗室（LGC）、中國計量院（采用SPE前處理，NIM-SPE）、本實驗（采用超聲結(jié)合乙酸乙酯液液萃取，NIM-ULE）、美國標(biāo)準(zhǔn)研究院（NIST）、日本計量研究實驗室（NMIJ）、德國物理技術(shù)研究室（PTB）測定結(jié)果分別為101.66， 101.40， 100.46， 100.49， 100.48， 98.47和101.31 μg/kg，不確定度分別為1.02， 1.50， 0.91， 0.78， 1.07， 1.06和0.97 μg/kg。

3.4 方法精密度、回收率和定量限

通過對3種不同含量（80.7， 105.4和165.2 μg/kg）血清樣品重復(fù)測定，檢驗本方法的精密度，日內(nèi)和日間含量測定值的精密度如表1所示。同時，通過加標(biāo)實驗測定方法的回收率，如表2所示。通過質(zhì)譜自帶數(shù)據(jù)處理軟件計算出不同含量血清氫化可的松樣品的信噪比，定量檢出限（10倍信噪比）為1.68 μg/kg。

3.5 血清氫化可的松含量穩(wěn)定性實驗

通過測定3個含量的自制樣品，判斷血清中氫化可的松在不同保存條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，直接融化和在室溫下保持24 h的血清中氫化可的松含量無明顯不同。一次融化復(fù)凍循環(huán)并無導(dǎo)致血清中氫化可的松含量減少，而在室溫下保持48 h和融化復(fù)凍兩次后，會導(dǎo)致血清中氫化可的松含量測定值略有（<0.5%）降低，而且實驗數(shù)據(jù)的不確定度也有所增加。

3.6 不同人體血清氫化可的松含量測定

在血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備過程中，必須保證血清中氫化可的松含量穩(wěn)定，因此，將血清按照男性健康人，男性腎病病人，女性健康人分類，并分別混勻。運(yùn)用本方法對其中的氫化可的松含量分別測定，得到如下結(jié)果：男性健康人、男性腎病病人和女性健康人中血清氫化可的松含量分別為100.6， 169.5和82.2 μg/kg，不確定度分別為0.60， 0.85和0.33 μg/kg。

4 結(jié) 論

本實驗采用超聲結(jié)合乙酸乙酯液液萃取的高準(zhǔn)確度同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜方法檢測血清中氫化可的松含量，靈敏度高，分析時間短，樣品前處理步驟簡單，消耗少。本方法的準(zhǔn)確度優(yōu)于文獻(xiàn)記載的其它常規(guī)方法，為血清中氫化可的松成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制奠定了基礎(chǔ)。