摘 要：建立了雙殼類水產(chǎn)品中原多甲藻酸貝類毒素Azaspiracid 1（AZA1）、Azaspiracid 2（AZA2） 和Azaspiracid 3（AZA3）的液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。選用具有基質(zhì)代表性的扇貝、牡蠣和雜色蛤為研究對象，樣品經(jīng)80%甲醇-水混合溶液提取，正己烷脫脂、氯仿反提萃取并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，MAX混合型陰離子交換反相吸附固相萃取柱凈化，Luna C18 色譜柱（150 mm×2.0 mm，5 μm，Phenomenex公司）反相液相色譜法分離，乙腈和0.1%甲酸溶液組成的流動相梯度洗脫，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定和確證，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，3種原多甲藻酸類貝類毒素均在4 min內(nèi)出峰，檢出限均為1.5 μg/kg，在0.3～30 μg/L范圍內(nèi)線性良好，平均回收率大于80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于12%（n=6）。

關(guān)鍵詞：貝類毒素；原多甲藻酸；雙殼類水產(chǎn)品；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

原多甲藻酸（Azaspiracids， AZAs）貝類毒素是一類脂溶性聚醚生物毒素，由原多甲藻（Properidininm crassipes）產(chǎn)生，碳骨架由40個碳原子組成，分子中有20個立體異構(gòu)中心和9個環(huán)，具有獨特的6，5，6-三螺環(huán)和環(huán)胺結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1），屬氨代螺旋酸類貝類毒素。AZA1在AZAs貝類毒素中最為常見，[TS（][HT5”SS] 圖1 原多甲藻酸類貝類毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

Fig.1 Chemical structure of azaspiracids （AZAs）

AZA1： R1=H， R2=CH3 ； AZA2： R1=CH3， R2=CH3； AZA3： R1=H， R2=H.[HT5][TS）]且所占比例最高，AZA2和AZA3則分別是AZA1的8-甲基和22-脫甲基衍生物，這3種貝類毒素構(gòu)成了原多甲藻酸類貝類毒素的主要成分^[1]。AZAs貝類毒素毒性強(qiáng)且比較穩(wěn)定，AZAl， AZA2和AZA3對小鼠腹腔注射致死劑量分別為200， 110和140 μg/kg^[2]，人食用含有AZAs貝類后會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、胃痙攣等癥狀。2002年3月，歐洲委員會規(guī)定雙殼類水產(chǎn)品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允許濃度為160 μg/kg （以貝肉計）^[3]。

小鼠生物檢測法（MBA）是以往檢測貝類毒素的常用方法，但因其存在不能判定多種毒素的具體組分，靈敏度和準(zhǔn)確性均欠佳，重現(xiàn)性差等缺點，已被歐盟于2011年采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法取代^[4]。目前，對AZAs貝類毒素的檢測多限于AZA1 [5～8]，而AZA1的測定結(jié)果不能作為雙殼類水產(chǎn)品中AZAs是否超標(biāo)的判斷依據(jù)，且所建檢測方法還存在著樣品處理操作繁瑣，耗時長等問題。本研究針對以上問題，完善了目標(biāo)分析物的種類，改進(jìn)了樣品處理方法，提高了分析效率，為雙殼類水產(chǎn)品中AZAs貝類毒素殘留的監(jiān)控及檢測提供了技術(shù)支持，為貝類產(chǎn)品的品質(zhì)控制和質(zhì)量提高提供了可靠保證。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

API4000液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），配有電噴霧離子源；T25 basic型均質(zhì)器（德國IKA公司）；2-16K型高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；MS3型渦旋混合器（德國IKA公司）； RV 10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；固相萃取裝置、MAX混合型陰離子交換反相吸附固相萃取小柱（美國Waters公司）。Mill-Q純水儀（美國Millipore公司）。

原多甲藻酸標(biāo)準(zhǔn)品：AZA1、AZA2和AZA3（加拿大海洋生物科學(xué)研究所，純度≥95%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Burdick Jackson公司）；甲酸（色譜純，美國Dikma公司）；氯仿（農(nóng)殘級，美國Tedia公司）；正己烷和乙酸鈉（優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。實驗用水由Mill-Q純水儀制備。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

取90 μg/L AZAs標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動注射方式分別注入離子源。在正離子檢測方式下對AZAs進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描獲得各分子離子峰[M+H]+，再對各母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描獲得相應(yīng)的特征子離子峰[M+H-H2O]+ 和[M+H-2H2O]+。然后通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式對去蔟電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞氣能量（CE）、碰撞室出口電壓（CXP）等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子與特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大，確定最佳質(zhì)譜參數(shù)。AZAs分子結(jié)構(gòu)中C20與C21位上存在兩個羥基，二者會被電離， 失去氧原子上的一個n電子，生成奇電子離子，游離基定域于氧上，并誘導(dǎo)β-氫重排到氧上，接著失去H2O^[9]，從而得到[M+H-H2O]+和 [M+H-2H2O]+兩個子離子。AZAs的二級質(zhì)譜圖見圖2。

3.2 色譜條件的選擇

選用Luna C18色譜柱對AZAs進(jìn)行分離，流動相則選用實驗室中常用的乙腈和0.1%甲酸，梯度洗脫。結(jié)果表明，3種AZA均具有較高的靈敏度和選擇性，且峰形尖銳，在3.0 min附近出峰，與文獻(xiàn)[6～8]相比，分析周期明顯縮短，且流動相組成簡單易得，易與其它檢測方法流動相兼容。

3.3 研究對象的選擇及樣品制備

本實驗選取扇貝、牡蠣和雜色蛤作為研究對象。扇貝多見于潮間帶到深海，牡蠣通常生活于適宜海區(qū)的巖石上，雜色蛤則大多棲息在風(fēng)浪較小的內(nèi)灣，且有適量淡水注入的中、低潮區(qū)潮間帶沙泥灘涂中。因棲息環(huán)境的不同，三者的肉質(zhì)存在一定差異，在雙殼類水產(chǎn)品中具有一定的代表性。

對于雙殼類水產(chǎn)品樣品，在制備過程中需先將其洗凈，去殼，再清洗殼內(nèi)組織，確保試樣中無海水和泥沙等雜質(zhì)。分析前取樣品可食部分進(jìn)行均質(zhì)處理，既保證試樣均勻性， 也利于提取效率的提高。

3.4 樣品分離純化方式和條件的選擇和優(yōu)化

3.4.1 提取條件的選擇和優(yōu)化 歐盟2011年出臺了協(xié)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)SOP方法：LC-MS/MS法測定貝類中脂溶性海洋生物毒素，該SOP方法采用100%甲醇提取，過膜后直接上機(jī)的方式測定試樣中的AZAs等毒素。本文根據(jù)AZAs貝類毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，以及相關(guān)文獻(xiàn)資料^[6]，分別嘗試用100%甲醇和80%甲醇溶液作為提取溶劑對試樣中的AZAs進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80%甲醇提取效果更佳，在回收率、提取后溶液純凈程度和便于后續(xù)凈化等方面均有較好的表現(xiàn)。歐盟協(xié)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)SOP方法采用100%甲醇作為提取劑可能是為了兼顧貝類中各種脂溶性海洋生物毒素都有較好的提取效果，而本實驗選用的80%甲醇則對AZAs類貝類毒素提取的針對性更強(qiáng)。

為了避免脂肪對提取凈化的影響，利用正己烷對80%甲醇提取液進(jìn)行了脫脂處理。因為甲醇-氯仿體系對于脂溶性目標(biāo)分析物有較好的提取效率，后續(xù)操作在提取液中加入了氯仿進(jìn)行反提萃取。預(yù)實驗過程中，考慮到氯仿具有一定的毒性，曾嘗試用乙酸乙酯取代氯仿進(jìn)行反提，但乙酸乙酯與上一步所得提取液不能夠很好地分層，反提效果不理想，所以該步驟采用氯仿進(jìn)行反提。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時，考慮到AZAs類貝類毒素對熱較穩(wěn)定，設(shè)定水浴溫度為50 ℃，這樣氯仿的濃縮時間明顯縮短，使得整個提取方法可操作性更強(qiáng)。為了保證樣品提取液在固相萃取柱上能夠充分保留，殘渣先用1 mL甲醇溶解確保目標(biāo)分析物不損失后，再加入4 mL水進(jìn)行潤洗。

姚建華等^[6]在提取貝類產(chǎn)品中AZA1時，整個提取過程中有兩次氮吹濃縮處理，這就使得整個實驗耗時較長，本實驗所建提取方法則在具有同樣提取效果的情況下有著更加省時快速的優(yōu)點。

3.4.2 凈化條件的選擇和優(yōu)化 AZAs是末端帶有羧基的并含有螺環(huán)的脂溶性含氮聚醚，兼具親水和親脂特性， MAX混合型陰離子交換反相吸附固相萃取小柱對其具有很好的選擇性。具體操作中，選取50 mmol/L 乙酸鈉溶液對MAX固相萃取小柱進(jìn)行淋洗，乙酸鈉為強(qiáng)堿弱酸鹽，溶液pH值偏堿性，這樣的酸堿度有利于AZAs完全離子化，使其在MAX固相萃取小柱上的吸附更加牢固；同時50 mmol/L乙酸鈉具有一定的離子強(qiáng)度，其與甲醇（95∶5，V/V）混合，對于去除雜質(zhì)具有很好的效果。洗脫液選用甲醇-甲酸（98∶2，V/V）溶劑體系，甲酸可與AZAs競爭MAX固相萃取小柱上的離子交換位點，甲醇則是非極性基團(tuán)很好的洗脫劑，二者組合而成的洗脫體系對于AZAs具有非常理想的洗脫效果。整個凈化過程，應(yīng)注意流速不可過快，以防止出現(xiàn)“溝渠效應(yīng)”而造成回收率降低^[10]。

通過以上提取過程中的氯仿反提萃取，以及凈化過程中對AZAs選擇性較強(qiáng)的MAX固相萃取小柱等分析手段的應(yīng)用，本文在保證回收率的前提下最大限度地降低了雙殼類水產(chǎn)品自身帶來的基質(zhì)效應(yīng)。

3.5 檢測下限和線性關(guān)系

以10倍信噪比（S/N）作為檢測下限（LOQ），測得AZAs在扇貝、牡蠣和雜色蛤等雙殼類水產(chǎn)品樣品中的LOQ均為1.5 μg/kg （濃度為0.3 μg/L）。姚建華等^[7]曾在大連海域貝類樣品中檢測出AZA1，含量為99.6 pg/g。而本文未過多追求更低的檢測下限，在歐盟AZAs總量不超過160 ng/g的檢測要求下，完全可以滿足雙殼類水產(chǎn)品中AZAs類貝類毒素日常檢測和監(jiān)控的需要。

用0.3，1.2，2.4，12和30 μg/L系列梯度濃度AZAs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次按方法2.2中描述的儀器條件進(jìn)行測定。每個濃度重復(fù)3次，通過標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Y與對應(yīng)的儀器響應(yīng)峰面積平均值X進(jìn)行線性回歸。在0.3～30 μg/L的濃度范圍內(nèi)線性良好，AZA1， AZA2和AZA3的相關(guān)系數(shù)分別為0.9992， 0.9990和0.9990。

3.6 回收率、精密度和樣品分析

歐洲委員會規(guī)定雙殼類水產(chǎn)品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允許濃度為160 μg/kg （以貝肉計）^[4]，即如果樣品中AZA1， AZA2和AZA3總量超過了160 μg/kg，則可判定其為陽性樣品。對于存在最高殘留限量（MRL）的物質(zhì)，一般設(shè)定LOQ， MRL和2MRL 3個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加濃度水平進(jìn)行相關(guān)的添加回收實驗。對于AZAs中的每個組分AZA1， AZA2和AZA3的MRL則可按照160 μg/kg的1/3對其基本限定，即60 μg/kg左右。因此，本文設(shè)定1.5， 60和120 μg/kg 3個濃度水平對AZA1， AZA2和AZA3進(jìn)行添加回收實驗。實際測試中，如果待測物濃度高于線性范圍則需稀釋待測物濃度使之在線性范圍內(nèi)，再通過乘以稀釋倍數(shù)的折算方式來計算AZAs濃度。以牡蠣為例，空白樣品加標(biāo)（1.5 μg/kg）的MRM色譜圖見圖3。