摘 要：建立了一種同時測定人體胸腔積液中酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）的液相色譜分析方法，并將其應(yīng)用于胸腔積液病因鑒別診斷。優(yōu)化的液相色譜條件如下： Vertex TM AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-10 mmol/L醋酸銨緩沖溶液（醋酸調(diào)至pH 5.6）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長為210和278 nm。結(jié)果表明，3種氨基酸在各自相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999； 信噪比為3時，檢出限（LOD）分別為0.50， 0.17和0.20 μmol/L。胸腔積液樣品經(jīng)甲醇去除蛋白質(zhì)后取上清液直接測定，3種氨基酸平均回收率在80.7%～101.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～8.7%。利用本方法對72例良惡性胸腔積液中的3種氨基酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Tyr， Phe和Trp含量在不同疾病的樣品中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對胸腔積液病因鑒別診斷有一定的臨床價值。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜； 氨基酸； 胸腔積液； 鑒別診斷

1 引 言

肺癌的發(fā)病率和死亡率在我國和全球都位列第一。目前肺癌的發(fā)現(xiàn)和診斷主要依靠影像學(xué)檢查和組織病理活檢，但存在一定漏診和誤診，組織活檢具有創(chuàng)傷性。原有的肺癌標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、細(xì)胞角蛋白片段19（CK19）、神經(jīng)烯醇酶（NSE）、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原（SCC）等^[1，2]， 其特異及敏感性欠佳。因此開發(fā)新的、敏感性更高、特異性更強(qiáng)的潛在標(biāo)志物對于肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、病理分型、藥物干預(yù)治療等方面具有重要的指導(dǎo)意義。

芳香族氨基酸是指含有芳香環(huán)的氨基酸，如酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp），其代謝狀態(tài)對人體具有重要的生理和病理意義。Neurauter等^[3]利用高效液相色譜對卵巢癌患者的血漿進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸濃度顯著高于正常人。Cascino等^[4]研究發(fā)現(xiàn)血漿中游離氨基酸對不同腫瘤疾病具有不同的影響，肺癌患者較正常人的血漿中蘇氨酸、絲氨酸和甘氨酸含量明顯下降，色氨酸和谷氨酸明顯升高，而乳腺癌患者中鳥氨酸、谷氨酸和色氨酸有明顯增加。Deng等^[5]應(yīng)用HPLC/MS技術(shù)對胃惡性腫瘤病人和正常人胃液進(jìn)行了對比分析，發(fā)現(xiàn)胃惡性腫瘤胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含量明顯高于正常人。研究表明，在惡性腫瘤患者和正常人血清、胃液等體液中，Tyr， Phe和Trp的芳香族氨基酸有明顯區(qū)別，可以作為一種潛在的診斷標(biāo)記物來篩選疾病。

目前，肺癌標(biāo)記物主要研究對象集中在血清^[6，7]、尿液^[8，9]等體液以及各種組織^{[10，11]}。胸腔積液是肺部疾病最為特異的人體體液，是肺癌或其他肺部疾?。ㄈ绶窝?、結(jié)核性胸膜炎等）的常見并發(fā)癥，是驗(yàn)證疾病病因、判斷其良惡性的重要媒介之一^[12]。目前對于良惡性胸腔積液的病因鑒別診斷研究主要集中在蛋白質(zhì)組學(xué)^[13，14]，而對于其中氨基酸類的小分子代謝物研究未見報道。胸腔積液中含有大量親水性物質(zhì)，常規(guī)的反相和正相液相色譜未能將氨基酸和樣品中復(fù)雜基質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離，而利用親水作用機(jī)理來分析生物樣品得到極大關(guān)注。本研究建立了基于極性基團(tuán)改性的C18柱的HPLC方法，對惡性胸腔積液（肺癌患者產(chǎn)生）和良性胸腔積液（肺部感染疾病產(chǎn)生）中Tyr、Phe和Trp進(jìn)行檢測，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討其對肺癌輔助診斷及確定臨床病理分型的意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 蛋白沉淀劑的選擇

在實(shí)驗(yàn)中，采用甲醇和乙腈兩種常用的有機(jī)蛋白沉淀劑做了對比分析。對于同一份胸腔積液樣分別用這兩種溶劑進(jìn)行沉淀蛋白，其余處理方法都相同。結(jié)果表明，經(jīng)過高效液相色譜分析，甲醇除蛋白后得到的色譜圖上具有更多的峰和更高的峰強(qiáng)度。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

對3種目標(biāo)化合物Tyr、Phe和Trp進(jìn)行全波長掃描，最大吸收波長分別為275， 210和278 nm，故采用278 nm對Tyr和Trp定量分析，采用210 nm對Phe定量分析。通過比較流動相中緩沖溶液的不同濃度（5， 10， 20和50 mmol/L）以及不同pH 值（4.6， 5.6， 6.6和7.6），確定乙腈-10 mmol/L醋酸銨緩沖溶液（pH 5.6）作為流動相。梯度洗脫程序如2.2節(jié)所述，一個樣品的分析在40 min內(nèi)可完成。

比較了Waters sunfire C18柱和Vertex TM AQ-C18柱對樣品中Tyr、Phe和Trp的分離效果，AQ-C18柱的流動相為上述優(yōu)化條件，而Waters sunfire C18柱的流動相條件如下： 流動相A為甲醇，流動相B為10 mmol/L醋酸銨緩沖溶液； 梯度洗脫程序： 0～5 min，10% A； 5～20 min，10%～30% A； 20～35 min，30%～60% A； 35～36 min，60%～10% A； 36～40 min，10% A。圖1中a和b分別是采用Waters sunfire C18柱在210和278 nm檢測波長下分離得到的色譜圖； c和d分別是采用Vertex TM AQ-C18柱在210和278 nm檢測波長下分離得到的色譜圖。由圖1可見，使用Waters sunfire C18柱時，酪氨酸不能得到有效分離，而AQ-C18色譜柱能使樣品中3種氨基酸均得到有效分離。這是因?yàn)槭褂肳aters sunfire C18柱時，流動相中水的比例一般不能超過90%，這不利于酪氨酸與胸腔積液中大量親水性物質(zhì)的分離。而AQ-C18色譜柱是一種極性基團(tuán)改性的C18柱，能與100%的水流動相兼容，對于親水性與極性化合物具有更強(qiáng)的保留能力和選擇性，因而使樣品中3種氨基酸既可有效分離，又各有合適的保留時間，且未受到其它色譜峰的干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Vertex TM AQ-C18色譜柱分析胸腔積液中的3種氨基酸。

3.4 良惡性胸腔積液中Tyr、Phe和Trp含量差別

采用本方法對72例肺癌和肺部良性疾病患者胸腔積液進(jìn)行了分析（圖2）。圖2中a～f分別為210和278 nm檢測波長下得到的3種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、惡性及良性胸腔積液的色譜圖。圖中1、2和3所指色譜峰分別為酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸，其保留時間分別為6.24， 9.23和12.09 min，3種芳香族氨基酸均得到了有效分離。根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算得到沉淀蛋白后每個樣品中3種物質(zhì)的含量（原實(shí)際樣品含量為該值的4倍，濃度分布范圍見表4），分別對肺癌組與肺部感染疾病組，肺癌組與結(jié)核性胸膜炎組，肺癌組與肺炎組以及結(jié)核性胸膜炎與肺炎組3種氨基酸含量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表4。