摘 要：將核殼型Fe3O4@Au磁性納米粒子修飾在絲網(wǎng)印刷工作電極表面，再通過納米金和微囊藻毒素-（亮氨酸-精氨酸）抗體（anti-MCLR）之間的吸附作用，將抗體固定于電極表面，以牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點(diǎn)，制得了檢測(cè)MCLR的電流型免疫傳感器。該傳感器基于直接競(jìng)爭(zhēng)的免疫分析模式，以辣根過氧化物酶偶聯(lián)的微囊藻毒素（MCLR-HRP）為標(biāo)記物，用差分脈沖伏安法檢測(cè)微囊藻毒素，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，此免疫傳感器響應(yīng)的峰電流值與微囊藻毒素濃度在0.79～12.9 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.38 μg/L。對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行了微囊藻毒素的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在95%～107%之間。此免疫傳感器具有測(cè)定速度快、靈敏高、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：Fe3O4@Au磁性納米粒子；微囊藻毒素；絲網(wǎng)印刷電極；免疫傳感器

1 引 言

微囊藻毒素（Microcystins， MCs）是毒性強(qiáng)、急性危害巨大的一種淡水藍(lán)藻毒素，有強(qiáng)烈的致肝癌作用，其中微囊藻毒素-（亮氨酸-精氨酸）（Microcystin-（leucine-arginine），MCLR）是最常見、急性毒性最強(qiáng)的微囊藻毒素之一^[1]。世界衛(wèi)生組織修訂的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》中限定檢出濃度為1 μg/L^[2]。目前，檢測(cè)MCLR的傳統(tǒng)技術(shù)主要有高效液相色譜法^[3，4]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)^[5]，這些方法雖然靈敏度高，但是需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作步驟繁瑣，且需要昂貴的儀器及專業(yè)的技術(shù)人員。采用植物細(xì)胞的生物測(cè)試法^[6]和蛋白磷酸酶抑制法^[7，8]靈敏度都較低。酶聯(lián)免疫吸附法雖然靈敏度較高，但是其線性范圍較窄^[9，10]。而利用辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記物，抗原和抗體之間的特異性免疫反應(yīng)制備的MCLR免疫傳感器，因其具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)微型化、特異性好等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。

近年來，磁性納米粒子作為一種新型的功能性材料成為當(dāng)前納米材料的研究熱點(diǎn)之一^[11～13]。其中，核殼型Fe3O4@Au納米復(fù)合材料所具有的獨(dú)特電化學(xué)性質(zhì)、催化特性、良好的穩(wěn)定性和生物相容性，使其適用于表面修飾和功能化研究^[14～17]。

絲網(wǎng)印刷電極（Screen-printed electrode，SPE）應(yīng)用于制作電化學(xué)生物傳感器已經(jīng)成為檢測(cè)環(huán)境污染物的常用的方法之一，其具有制作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、便于攜帶、可一次性使用等優(yōu)點(diǎn)^[18～21]。

本研究基于Fe3O4@Au磁性納米復(fù)合材料修飾絲網(wǎng)印刷電極構(gòu)建了檢測(cè)MCLR的免疫傳感器。利用放置在絲網(wǎng)印刷電極背面的磁鐵所形成的磁場(chǎng)，可將Fe3O4@Au吸附在碳工作電極表面，再通過納米金和微囊藻毒素抗體（anti-MCLR）之間的吸附作用^[1，22]，將抗體固定在電極表面，采用直接競(jìng)爭(zhēng)模式，使辣根過氧化物酶標(biāo)記的微囊藻毒素（MCLR-HRP）與待測(cè)液中的MCLR競(jìng)爭(zhēng)免疫結(jié)合電極表面的anti-MCLR，通過差分脈沖伏安法檢測(cè)底物H2O2和對(duì)苯二酚（HQ）的催化電流，構(gòu)建了一種快速、靈敏、易攜帶的MCLR免疫傳感器。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

AT-25PA電動(dòng)式平面網(wǎng)印機(jī)（東遠(yuǎn)機(jī)械工業(yè)（昆山）有限公司）；CHI 830B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；透射電子顯微鏡（JEM-1200EX）。

MCLR、anti-MCLR和HRP-MCLR（北京伊普瑞斯有限公司）；CNB-7 導(dǎo)電碳漿、CAN-24導(dǎo)電銀漿（徐州博匯新材料科技有限公司）；藍(lán)色絕緣油墨（上海正庭絲網(wǎng)印刷材料有限公司）；PVC 硬板（北京雅諾藝印刷器材有限責(zé)任公司）；氯金酸（HAuCl4）（Sigma公司）。其它試劑均為分析純。封閉緩沖溶液為含1%牛血清白蛋白（BSA）的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）。為了減小非特異性吸附，用含有0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS（PBST，pH 7.4）作為淋洗的緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 Fe3O4@Au納米復(fù)合材料的制備

按文獻(xiàn)[23]的方法，合成核殼型Fe3O4@Au納米粒子，并且做了小幅度修改。首先，移取0.85 mL HCl（12 mol/L），與25 mL水混合均勻，用高純氮?dú)獬?0min，稱取5.2 g FeCl3·6H2O，2.0 g FeCl2·4H2O，溶解于上述HCl溶液中，在充分?jǐn)嚢璨⑶业獨(dú)夥毡Ｗo(hù)的條件下，將該溶液逐滴加入溫度為80 ℃的250 mL 1.5 mol/L NaOH溶液中，熟化1h，利用磁鐵將所獲得的Fe3O4納米粒子從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，用水沖洗數(shù)次，分散于100 mL水中。

用100 mL 0.01 mol/L氫氧化四甲基銨（TMAOH）與5 mL 上述Fe3O4納米粒子懸濁液和3 mL 0.2 mol/L NH2OH·HCl混合均勻，加熱至80 ℃，在充分?jǐn)嚢韬偷獨(dú)夥毡Ｗo(hù)的條件下，逐滴加入50 mL 0.1% HAuCl4，然后，在2 h之內(nèi)逐步加入100 mL 15 mol/L檸檬酸鈉溶液，攪拌4 h，在整個(gè)過程中，始終保持溶液溫度為80 ℃，并且氮?dú)夥毡Ｗo(hù)，以阻止氧氣的溶入。當(dāng)懸濁液冷卻到室溫后，用磁鐵分離出固體顆粒，并用水沖洗2次，乙醇沖洗2次，室溫晾干。用水將晾干粉末配制成1.0 g/L懸濁液保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

2.3 免疫傳感器的制備

2.3.1 絲網(wǎng)印刷電極的制備 將導(dǎo)電銀漿印刷到PVC板表面，放入烘箱中于90 ℃干燥30 min，再印刷碳漿，放入烘箱中于90 ℃干燥15 min，然后印刷絕緣漿，放入烘箱中于80 ℃干燥10 min，自然冷卻至室溫后于4 ℃干燥保存。使用前用水沖洗，其工作電極半徑為1.5 mm。圖1是SPE的印刷制備過程示意圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 Fe3O4@Au納米復(fù)合材料的表征

圖3中的A和B分別為Fe3O4磁性納米粒子和Fe3O4@Au復(fù)合納米粒子的透射電鏡圖（TEM），圖3C 為Fe3O4@Au的能譜圖（EDS），D為這兩種納米粒子的磁滯回線。由圖3A可見，本實(shí)驗(yàn)合成的Fe3O4磁性納米粒徑約為10 nm，而圖3B中趨于黑色球型的物質(zhì)為金殼包裹住的Fe3O4磁性納米材料，粒徑偏大，約為15～20 nm，且分散均勻，圖3B中Fe3O4@Au的顏色比圖3A中單純的Fe3O4磁性納米粒子略深，這是由于Fe3O4表面包覆上的Au電子密度更高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移電子數(shù)較少造成的^[24]。因此，從納米粒子粒徑和顏色的改變可以證明本研究合成的納米復(fù)合材料屬于核殼型Fe3O4@Au。圖3C的EDS圖進(jìn)一步表明，該納米復(fù)合材料中元素Au、Fe和O的相對(duì)含量較高，圖3D表明，兩種納米磁球不僅具有強(qiáng)磁性，可實(shí)施磁分離，而且無剩磁和磁滯現(xiàn)象，表現(xiàn)為超順磁。因此，本實(shí)驗(yàn)成功制備了超順磁性的核殼型Fe3O4@Au納米復(fù)合材料。

3.2免疫傳感器的電化學(xué)特性

采用差分脈沖伏安法（DPV）研究了電極在組裝過程中的電化學(xué)特性。圖4中曲線a為裸SPE上固定抗體并免疫吸附MCLR-HRP的陽(yáng)極伏安掃描曲線，峰電流較小。曲線b為MCLR-HRP/anti-MCLR/Fe3O4@Au/SPE在底液中的差分脈沖伏安曲線；與曲線a相比，氧化峰電流明顯增大，這是因?yàn)?Fe3O4@Au不僅加快了電子的傳輸能力，而且增大了電極的比表面積。曲線c是免疫電極在有游離MCLR和MCLR-HRP存在的情況下，反應(yīng)一段時(shí)間后的電化學(xué)信號(hào)；與曲線a比較，曲線c的峰電流明顯減小，這是由于MCLR和HRP-MCLR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到了免疫電極表面，使HRP-MCLR的結(jié)合量變少所致。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.3.1 緩沖溶液pH值的優(yōu)化 在pH 5.5～8.0范圍內(nèi)，考察了PBS的pH值對(duì)免疫傳感器的響應(yīng)影響。隨著pH值增大，免疫傳感器的氧化峰電流先逐漸增大再減小，當(dāng)pH=7.0時(shí)，氧化峰電流值達(dá)到最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0的PBS作為測(cè)試底液。

3.3.2 MCLR-HRP濃度的優(yōu)化 免疫傳感器的電流響應(yīng)靈敏度以及電極表面的免疫復(fù)合物的形成都與孵育液中的MCLR-HRP濃度有關(guān)，為了得到最佳的MCLR-HRP濃度，將anti-MCLR/Fe3O4@Au/SPE在不同濃度的MCLR-HRP溶液中進(jìn)行孵育，如圖5所示，氧化峰電流隨著MCLR-HRP濃度的增加而增大，當(dāng)MCLR-HRP濃度達(dá)到或超過10 mg/L時(shí)，氧化峰電流不再增大，表明此時(shí)工作電極表面的anti-MCLR的結(jié)合位點(diǎn)全部與MCLR-HRP結(jié)合，所以，本研究選10 mg/L MCLR-HRP作為最佳的酶標(biāo)抗原濃度。

3.3.3 孵育時(shí)間的優(yōu)化

抗體與抗原之間的免疫反應(yīng)與孵育時(shí)間有關(guān)，將10 μL 10 mg/L HRP-MCLR滴涂在工作電極表面，分別在室溫下保濕孵育5， 10， 20， 30， 40和50 min。在5～20 min，峰電流隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加， 到20 min時(shí)獲得最大響應(yīng)信號(hào)，繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間直到50 min，電流響應(yīng)略有減小，如圖5b所示。所以，選20 min作為最佳孵育時(shí)間。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)e3O4@Au納米復(fù)合材料具有良好的生物相容性，較強(qiáng)的選擇性以及較高的穩(wěn)定性，能固載更多的抗體，提高了免疫傳感器的靈敏性。本研究構(gòu)建了一種基于Fe3O4@Au納米復(fù)合材料修飾絲網(wǎng)印刷電極的免疫傳感器，依靠磁鐵提供的磁場(chǎng)直接將超順磁性Fe3O4@Au固定到工作電極表面，并采用直接競(jìng)爭(zhēng)模式，檢測(cè)MCLR，該方法簡(jiǎn)單快捷，有利于實(shí)現(xiàn)MCLR的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定。實(shí)際水樣的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。