摘 要：建立了以12種同位素標(biāo)記氨基酸做內(nèi)標(biāo)，采用衍生化方法，LC-MS/MS采用MRM方式同時(shí)定量30種氨基酸的檢測(cè)方法。生物樣本加入含有同位素內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液，沉淀蛋白后氮?dú)獯蹈杉尤胙苌噭?，樣本氨基酸與同位素氨基酸內(nèi)標(biāo)同步衍生，減小實(shí)驗(yàn)誤差。選用TC-C18色譜柱，以水-乙腈（均含有0.01%七氟丁酸和0.1%甲酸）為流動(dòng)相，采用梯度洗脫進(jìn)行分離，30種氨基酸及其中的同分異構(gòu)體都能基線分離。選用3200QTRAP型質(zhì)譜儀的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。本方法用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)惡性血液病患者血漿氨基酸譜的變化，可以直接反映機(jī)體的代謝及營(yíng)養(yǎng)狀況，對(duì)患者的移植成功率及改善移植后患者的生存質(zhì)量均有重要意義。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；氨基酸；高通量定量；同位素內(nèi)標(biāo)；惡性血液病

1 引 言

氨基酸是生命的基石，是人體基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是蛋白質(zhì)的組成單位。生命的產(chǎn)生、存在和消亡，均與蛋白質(zhì)有關(guān)，而氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位，如果人體缺乏氨基酸，就會(huì)導(dǎo)致生理功能異常，影響機(jī)體代謝的正常進(jìn)行，導(dǎo)致疾病。檢測(cè)復(fù)雜樣本中氨基酸的含量對(duì)臨床和科研等都具有重要意義。

目前，氨基酸檢測(cè)技術(shù)繁多，1958年Spackman等首先提出了用陽(yáng)離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋白質(zhì)中的氨基酸^[1]， 實(shí)現(xiàn)了氨基酸分析的自動(dòng)化^[2]。其后，新的氨基酸分析方法不斷涌現(xiàn)，柱前衍生反相高效液相色譜法^[3～5]、毛細(xì)管電泳法^[6]、質(zhì)譜法等相繼應(yīng)用于氨基酸分析^[2，7～14]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）充分整合了液相色譜對(duì)復(fù)雜樣本的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，在生物體內(nèi)源性小分子定性與定量方面有廣泛應(yīng)用，LC-MS/MS用于體內(nèi)外氨基酸的檢測(cè)在一定程度上解決了復(fù)雜基質(zhì)干擾問(wèn)題，極大地提高了檢測(cè)水平和檢測(cè)靈敏度，并實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)。

在文獻(xiàn)[9～13]基礎(chǔ)上，結(jié)合前期氨基酸定量檢測(cè)工作經(jīng)驗(yàn)^[14]，本實(shí)驗(yàn)探索了同位素內(nèi)標(biāo)和衍生化技術(shù)準(zhǔn)確定量分析氨基酸的方法，采用12種穩(wěn)定同位素氨基酸為內(nèi)標(biāo)，樣本用鹽酸正丁醇衍生化，經(jīng)柱分離后進(jìn)行LC-MS/MS定量檢測(cè)，準(zhǔn)確度比新生兒遺傳代謝病LC-MS/MS篩查方法^[9]有很大提高，且實(shí)驗(yàn)原理簡(jiǎn)單明確，樣本前處理快速，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可為臨床、科研等提供準(zhǔn)確的氨基酸參考數(shù)據(jù)。應(yīng)用本方法對(duì)惡性血液病造血干細(xì)胞微移植患者和正常人群的血漿氨基酸進(jìn)行了測(cè)定，為臨床惡性血液病患者的營(yíng)養(yǎng)監(jiān)測(cè)和合理營(yíng)養(yǎng)支持提供了理論依據(jù)。

2.5 定量及數(shù)據(jù)處理

樣本處理后經(jīng)LC-MS/MS平臺(tái)上特定的采集方法運(yùn)行，得到總離子流圖（圖1），提取30種氨基酸對(duì)應(yīng)的樣本和內(nèi)標(biāo)的MRM離子流圖，進(jìn)行積分處理。每5 μL進(jìn)樣中，含有12.5 pmol從日常工作液中帶入的精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天門(mén)冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、纈氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸同位素內(nèi)標(biāo)衍生物，62.5 pmol甘氨酸同位素內(nèi)標(biāo)衍生物，沒(méi)有同位素內(nèi)標(biāo)的18種氨基酸采用色譜峰比較鄰近的同位素進(jìn)行定量分析，以特定的校正系數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。通過(guò)對(duì)比50個(gè)樣本使用本研究方法直接測(cè)定的氨基酸結(jié)果與穩(wěn)定同位素iTRAQ標(biāo)記LC-MS/MS方法^[14]測(cè)定結(jié)果，產(chǎn)生每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的特定校準(zhǔn)系數(shù)K。

3 結(jié)果與討論

3.1 30種氨基酸高通量檢測(cè)樣本方法

方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性是通過(guò)特定的質(zhì)控樣本來(lái)評(píng)價(jià)的，準(zhǔn)備并分裝多份質(zhì)控樣本，采用穩(wěn)定同位素iTRAQ標(biāo)記LC-MS/MS方法3次測(cè)定結(jié)果作為理論值，以實(shí)際測(cè)試中不同批次質(zhì)控樣本的相對(duì)誤差（RE）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。經(jīng)多批次20個(gè)質(zhì)控樣本分析結(jié)果顯示： 30種氨基酸最低定量限均大于0.5 μmol/L，30種氨基酸RE均小于15%，除半胱氨酸（RSD=32%）、肌氨酸（RSD=28%）外，其余氨基酸RSD均小于20%，考慮體內(nèi)外樣本氨基酸檢測(cè)的復(fù)雜性和難度，綜合認(rèn)為本研究所建立的方法可用于體內(nèi)外氨基酸的準(zhǔn)確定量。

在本梯度條件下，采用高保留色譜柱進(jìn)行分離，在15 min可以同時(shí)檢測(cè)44種離子對(duì)，涉及30種氨基酸及對(duì)應(yīng)的12種同位素內(nèi)標(biāo)，同分異構(gòu)體（肌氨酸、丙氨酸，γ-氨基丁酸、α-氨基正丁酸，亮氨酸、異亮氨酸，1-甲組氨酸、3-甲組氨酸等）均能夠基線分離，見(jiàn)圖2。

3.3 LC-MS/MS氨基酸檢測(cè)方法討論

采用0.01%七氟丁酸-0.1%甲酸的乙腈-水為流動(dòng)相，若僅采用乙腈-水作為流動(dòng)相，氨基酸的峰形會(huì)有拖尾、寬峰等現(xiàn)象。加入0.01%七氟丁酸可以促進(jìn)氨基酸在色譜柱上的保留，改善峰形。但當(dāng)七氟丁酸含量升高時(shí)會(huì)抑制質(zhì)譜信號(hào)，七氟丁酸尤其對(duì)質(zhì)譜的負(fù)離子掃描有影響，所以用量一定要合適。而加入甲酸可以提供質(zhì)子，增強(qiáng)正離子化信號(hào)，并提高氨基酸色譜峰信噪比，降低定量限，樣本中可以達(dá)到很好的定量分析效果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為解決出峰過(guò)寬的問(wèn)題，適當(dāng)提高有機(jī)相比例，既改善了峰形， 又縮短了出峰時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用的是高水相的C18色譜柱，此色譜柱在溫度較高時(shí)保留會(huì)更好，綜合多方面因素，采用了時(shí)間15 min，柱溫50 ℃的梯度洗脫模式。

氨基酸和氨基酸衍生物分子量均較小，應(yīng)選用較小的離子噴射電壓，但由于流速為800 μL/min，離子噴射電壓不宜太低，經(jīng)過(guò)優(yōu)化調(diào)試發(fā)現(xiàn)離子噴射電壓在5500 V時(shí)信號(hào)較高且穩(wěn)定。而離子化溫度低于500 ℃時(shí)，離子化程度不充分，影響氨基酸檢測(cè)響應(yīng)值和定量結(jié)果，當(dāng)離子化溫度過(guò)高（>650 ℃），又會(huì)造成離子化過(guò)程中部分中性基質(zhì)碳化或焦化，污染離子源，降至580 ℃后離子化效果較好且不易焦化。氣簾氣選用140 kPa，氣簾氣過(guò)小容易污染使中性分子和污染物進(jìn)入質(zhì)譜，造成基線過(guò)高而影響準(zhǔn)確度。

本實(shí)驗(yàn)樣本需要衍生處理，但衍生處理原理和操作均較簡(jiǎn)單。用正丁醇的羥基在HCl存在的環(huán)境下與氨基酸的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，生成氨基酸衍生物，提高分子量并將氨基酸碎片離子從低分辨率的背景中脫離出來(lái)，提高檢測(cè)的靈敏度，降低檢測(cè)難度。實(shí)驗(yàn)條件較易控制，若樣本批量較大時(shí)，可以采用96孔板處理，提高工作效率。由于采用了同位素內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)氨基酸與樣本中需要檢測(cè)的氨基酸進(jìn)行平行同步處理，所以色譜行為、質(zhì)譜的離子化效率和基質(zhì)效應(yīng)均能完全一致，避免了系統(tǒng)誤差。

3.4 惡性血液病患者血漿氨基酸譜的變化

本實(shí)驗(yàn)建立了一種高靈敏度和準(zhǔn)確性的30種氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分異構(gòu)體基本都能基線分離，方法操作簡(jiǎn)單、快速、高通量，可成功用于臨床診療和科研樣本的檢測(cè)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)惡性血液病患者的血漿氨基酸在微移植治療過(guò)程中的變化，能夠反映某些營(yíng)養(yǎng)素的缺乏，為進(jìn)一步營(yíng)養(yǎng)支持提供更有針對(duì)性和科學(xué)性的依據(jù)。