摘 要：構(gòu)建了一種依賴于表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)檢測(cè)脂多糖氧化產(chǎn)物甲醛，實(shí)現(xiàn)對(duì)脂多糖的定量檢測(cè)。在室溫條件下，用NaIO4氧化脂多糖生成甲醛，加入巰基拉曼染料4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三氮唑（Purpald）與甲醛加合，再加入NaIO4進(jìn)一步氧化，生成的紫色終產(chǎn)物組裝到金納米顆粒表面，在進(jìn)行拉曼光譜掃描時(shí)產(chǎn)生了SERS增強(qiáng)信號(hào)，而在控制實(shí)驗(yàn)中沒有脂多糖參與時(shí)，得到非常弱的SERS信號(hào)，由此實(shí)現(xiàn)脂多糖的檢測(cè)。此外，利用紫外可見光譜對(duì)脂多糖的氧化產(chǎn)物進(jìn)行了分析，在540 nm處有甲醛與Purpald加成產(chǎn)物特征的紫外吸收。還對(duì)NaIO4、Purpald的反應(yīng)濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在最優(yōu)反應(yīng)條件下，SERS信號(hào)隨著脂多糖濃度增大而增強(qiáng)，在33～667 mg/L范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，檢出限為21 mg/L。本方法無需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作和昂貴的標(biāo)記試劑。分析速度快，靈敏度高。

關(guān)鍵詞：脂多糖； 金納米顆粒； 表面增強(qiáng)拉曼散射

1 引 言

細(xì)菌等微生物的鑒定和檢測(cè)在發(fā)酵工程、醫(yī)療實(shí)踐和環(huán)境監(jiān)測(cè)方面都具有重要意義。作為細(xì)菌的內(nèi)毒素，脂多糖（LPS）已經(jīng)成為診斷革蘭氏陰性細(xì)菌的重要標(biāo)志^[1，2]。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁層的主要成分，用于保持細(xì)胞外膜的完整性和避免細(xì)菌受到外界抗生素的入侵^[3]。脂多糖由O-特異性多糖鏈、核心多糖鏈和類脂A三部分組成^[4，5]。脂多糖可以從細(xì)菌的細(xì)胞壁上脫落， 釋放進(jìn)入人體，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引起敗血性休克，器官衰竭，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡^[6，7]。在美國，每年敗血癥和敗血性休克的患者多達(dá)150000^[8]。世界范圍內(nèi)，尤其是對(duì)于生存環(huán)境惡劣和水源不能進(jìn)行滅菌處理的地區(qū)，這個(gè)數(shù)字仍在上升。因此，脂多糖的分析對(duì)相關(guān)疾病的診斷和治療有著重要的意義。目前已經(jīng)報(bào)道的脂多糖檢測(cè)的方法包括內(nèi)毒素鱟試劑測(cè)定法（Limulus amebocyte lysate，LAL）^[9]，氣相色譜-質(zhì)譜分析^[10]，電化學(xué)分析^[11，12]，功能化聚二乙炔脂質(zhì)體的比色^[13]和熒光分析^[14]，熒光共振能量轉(zhuǎn)移用于研究熒光基團(tuán)標(biāo)記的脂多糖結(jié)合肽信標(biāo)與脂多糖的相互作用^[15]，以及基于陽離子的高聚物或者合成化學(xué)小分子的分析方法等^[16～20]。但是，這些方法或需要繁瑣的酶反應(yīng)，或探針需要標(biāo)記和復(fù)雜的化學(xué)合成。

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)因具有高靈敏、高選擇性以及適合均相物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究等特點(diǎn)，逐漸在生物學(xué)、分析科學(xué)、材料科學(xué)以及表面科學(xué)等方面得到廣泛應(yīng)用^[21～24]。由于脂多糖分子中存在鄰二醇結(jié)構(gòu)，可被NaIO4氧化生成甲醛，利用醛類反應(yīng)探針可以實(shí)現(xiàn)SERS的化學(xué)增強(qiáng)效應(yīng)。本研究建立了一種依賴于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)檢測(cè)脂多糖氧化產(chǎn)物甲醛來實(shí)現(xiàn)對(duì)脂多糖的定量檢測(cè)的方法。所用反應(yīng)活性探針是4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三氮唑（Purpald），該探針可以選擇性地與甲醛加成^[25]，加合產(chǎn)物可以通過巰基自組裝到金納米顆粒（AuNPs）表面，產(chǎn)生增強(qiáng)的SERS信號(hào)。與傳統(tǒng)方法相比，本方法簡(jiǎn)單方便、快速、靈敏，且不需要酶反應(yīng)及復(fù)雜的化學(xué)合成和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，且引入了一段較短的親水性多肽用于金納米顆粒的表面修飾，提高了金納米顆粒的穩(wěn)定性^[26]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與試劑

大腸桿菌脂多糖（E.coli LPS），由本實(shí)驗(yàn)室提取，首先對(duì)大腸桿菌菌株進(jìn)行活化、篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)，然后收集生長(zhǎng)旺盛期的細(xì)菌，制成細(xì)菌懸液。獲得的菌液經(jīng)5000 r/min離心20 min，0.9% NaCl離心洗滌1～2次， 制成濃菌液。用超聲波發(fā)生器中頻（相當(dāng)于12000 cps）處理20 min。處理液經(jīng)3000 r/min離心30 min，吸取上清液即為大腸桿菌脂多糖，真空旋干。4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三氮唑（Purpald，西格瑪公司）。親水性多肽Peptide序列：Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu（上海A′Peptide 公司合成純化， 純度>95%）。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2.2 多肽修飾金納米顆粒的制備

采用檸檬酸鈉還原HAuCl4法制備金納米顆粒。制備平均粒徑為30 nm的金納米顆粒：200 mL超純水中加入500 μL 4% （w/w） HAuCl4，攪拌下加熱至沸騰后迅速加入2.5 mL 1%（w/w）檸檬酸鈉，待溶液顏色不再改變后繼續(xù)攪拌加熱15 min，然后置于室溫下冷卻，4 ℃保存。使用UV 2450紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）測(cè)得該金溶膠的吸收波長(zhǎng)為530 nm，則粒徑為30 nm。

取2 mL所制備的AuNPs 10000 r/min離心10 min，用水定容至600 μL，在攪拌的條件下緩慢加入64 μL 0.01 g/LPeptide，用0.2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 6～8，在4 ℃放置過夜。將上述AuNPs-peptide 10000 r/min離心10 min，純水洗去未標(biāo)記上Peptide，最后定容至200 mL，所得AuNPs-peptide溶液的濃度為3 nmol/L，放置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3 結(jié)果與討論

3.1 基于SERS檢測(cè)技術(shù)用于脂多糖分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用甲醛選擇性反應(yīng)探針Purpald， 設(shè)計(jì)了一種新型生物傳感器，通過檢測(cè)脂多糖氧化產(chǎn)物甲醛和Purpald的加合產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物革蘭氏陰性細(xì)菌的標(biāo)志分子脂多糖含量的SERS檢測(cè)，原理如圖1所示。文獻(xiàn)[27]報(bào)道，脂多糖分子中含有多種糖結(jié)構(gòu)，其中庚糖和2-酮基-3-脫氧辛烷（2-keto-3-deoxyoctonate，kdo）分子中含有的鄰二醇結(jié)構(gòu)易被NaIO4氧化產(chǎn)生甲醛。脂多糖分子被NaIO4氧化而生成的甲醛與Purpald反應(yīng)，產(chǎn)物被NaIO4進(jìn)一步氧化， 生成的紫色終產(chǎn)物， 通過巰基自組裝于多肽修飾的金納米顆粒表面， 產(chǎn)生拉曼增強(qiáng)信號(hào)；而在控制實(shí)驗(yàn)中，Purpald 自組裝到金納米顆粒表面產(chǎn)生非常弱的拉曼信號(hào)。該方法與其它檢測(cè)方法相比具有很多優(yōu)點(diǎn)： （1）反應(yīng)探針Purpald幾乎沒有背景拉曼信號(hào)，它自身可以作為一種非熒光型拉曼染料，可降低熒光背景干擾，而它與甲醛的加合產(chǎn)物由于存在較好的π共軛效應(yīng)，具有很強(qiáng)的拉曼信號(hào)，因此提高了信背比； （2）金納米顆粒表面修飾了短的親水性多肽，可增強(qiáng)金納米顆粒在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性； （3）均相反應(yīng)，且無需任何的生物分子標(biāo)記，降低了實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、易于操作，檢測(cè)時(shí)間短，提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性。

3.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

對(duì)脂多糖氧化反應(yīng)中的NaIO4加入濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖4所示。隨著NaIO4濃度的增加，固定濃度的脂多糖（500 mg/L）產(chǎn)生的SERS信號(hào)逐漸增強(qiáng)，這主要是因?yàn)镹aIO4濃度相對(duì)于脂多糖是不足夠的，因此更多的NaIO4使脂多糖氧化更充分。當(dāng)NaIO4濃度到達(dá)1.1 mmol/L時(shí)出現(xiàn)平臺(tái)，說明NaIO4已經(jīng)能夠氧化全部的脂多糖，且在此濃度下信背比最高，因此選擇此濃度進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。另外，為了保持體系的穩(wěn)定，NaIO4濃度優(yōu)化幅度不大，因?yàn)檫^多的Na+會(huì)影響體系的穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的范圍內(nèi)體系較為穩(wěn)定，也未觀察到納米金團(tuán)聚的現(xiàn)象。

對(duì)甲醛選擇性反應(yīng)試劑Purpald的濃度也進(jìn)行了優(yōu)化（圖5）。由圖5可見，隨著Purpald試劑濃度的增加，固定濃度的脂多糖（500 mg/L）產(chǎn)生的SERS信號(hào)先增加，達(dá)到最高值后降低。這是因?yàn)樽銐虻腜urpald試劑濃度是保證加成反應(yīng)順利高效進(jìn)行的條件，但是過多的Purpald會(huì)與加成產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)吸附到納米金表面，降低SERS信號(hào)。Purpald最佳反應(yīng)濃度為22.7 mmol/L，選擇該濃度用于定量分析。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了基于甲醛選擇反應(yīng)探針用于SERS檢測(cè)脂多糖的分析方法。方法依賴于脂多糖中含有的鄰二醇結(jié)構(gòu)被氧化生成甲醛，甲醛與Purpald發(fā)生加成反應(yīng)，并進(jìn)一步氧化生成紫色的終產(chǎn)物，該產(chǎn)物組裝到多肽標(biāo)記的金納米顆粒表面可增強(qiáng)SERS信號(hào)。與傳統(tǒng)方法相比，本方法無需復(fù)雜的化學(xué)合成和標(biāo)記，不需要酶反應(yīng)，均相、靈敏、快速、易于實(shí)現(xiàn)。綜上優(yōu)點(diǎn)，本方法為革蘭氏陰性細(xì)菌標(biāo)志分子脂多糖的檢測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單，方便，靈敏，重現(xiàn)性好的均相檢測(cè)平臺(tái)。