摘 要：通過系統(tǒng)考察血清樣本前處理方法、優(yōu)化液相色譜條件及質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)，建立了脂質(zhì)組學(xué)血清樣本前處理及其快速高分辨液相色譜-質(zhì)譜（RRLC-MS）分析方法。血清樣本中加入二氯甲烷-甲醇（CH2Cl2-CH3OH，2∶1， V/V）混合溶劑進(jìn)行脂質(zhì)提取，采用ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），以10 mmol/L 甲酸銨溶液（含0.1% 甲酸）為流動(dòng)相A，乙腈-異丙醇（1∶1， V/V）為流動(dòng)相B，梯度洗脫，采用正負(fù)離子檢測(cè)模式電噴霧電離（±）ESI、正離子檢測(cè)模式大氣壓化學(xué)電離 （+）APCI方式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。對(duì)血清中脂肪酸、甘油脂、鞘磷脂、甘油磷脂和膽固醇（酯）5類14種代表性脂質(zhì)類成分進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，方法靈敏度高、精密度及穩(wěn)定性良好。對(duì)穿插在檢測(cè)序列中的質(zhì)控樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行主成分分析（PCA），證明了本方法獲得數(shù)據(jù)的可靠性良好，適用于脂質(zhì)組學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：脂質(zhì)組學(xué)； 血清前處理方法； 液相色譜-質(zhì)譜

1 引 言

隨著20世紀(jì)系統(tǒng)生物學(xué)的興起，在代謝組學(xué)的基礎(chǔ)上，2003年脂質(zhì)組學(xué)研究正式被提出^[1]，并被應(yīng)用于疾病診斷、藥物開發(fā)等領(lǐng)域的研究^[2]。在脂質(zhì)組學(xué)研究中，從生物樣本中提取脂質(zhì)類成分的完整性對(duì)脂質(zhì)組學(xué)分析方法有非常重要的意義。傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”法即“Folch or bligh and dyer recipes”法（采用CHCl3-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶劑）是目前最常用的脂質(zhì)類成分提取方法^[3～5]。然而氯仿具有致癌性^[6]，且氯仿降解后產(chǎn)生光氣、氯化氫氣體，可能使不穩(wěn)定的脂質(zhì)類成分發(fā)生化學(xué)修飾^[7]，影響脂質(zhì)組學(xué)分析測(cè)定的準(zhǔn)確性。目前文獻(xiàn)報(bào)道了改進(jìn)的二氯甲烷-甲醇（CH2Cl2-CH3OH）提取法^[8]和甲基叔丁基醚-甲醇（MTBE-CH3OH）提取法^[9]以及兩種方法分別與金標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比研究^[9～11]。但是未見對(duì)3種提取方法的系統(tǒng)比較，文獻(xiàn)報(bào)道的脂質(zhì)組學(xué)分析方法中未見關(guān)于樣本穩(wěn)定性的考察研究^{[8，12，13]}。本研究采用（±）ESI、（+）APCI相結(jié)合的RRLC-MS技術(shù)，可以獲得含有更全面質(zhì)譜信息的脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。選取血清中14種代表性脂質(zhì)類成分，系統(tǒng)考察了脂質(zhì)類成分的提取方法，并對(duì)分析過程中涉及到的處理前、處理過程中及處理后的血清樣本在不同放置條件及存放時(shí)間進(jìn)行穩(wěn)定性考察與驗(yàn)證，旨在排除外界因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，保證分析結(jié)果的客觀性^[14～16]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200系列快速高分辨液相色譜儀（德國Waldbronn Aglient technologies 公司）；QTRAPTM5500型四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems/MDS SCIEX公司），配有ESI源、APCI源及Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

脂質(zhì)類成分標(biāo)準(zhǔn)品的信息見表1（依據(jù)網(wǎng)站Lipid Maps（http：//www.lipidmaps.org） 命名），甲酸銨（色譜純）均購自美國Sigma-Aldric公司。乙腈、異丙醇和甲酸（色譜純，Merck公司）。實(shí)驗(yàn)用水為某品牌純凈水。

2.3 脂質(zhì)類成分標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣本的制備

（1）脂質(zhì)類成分標(biāo)準(zhǔn)品混合液：稱取14種脂質(zhì)類成分標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別溶于CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶劑，制備標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，SM（d18∶1/16∶0）和PE（14∶0/14∶0）濃度為0.1 mg/mL； PC（18∶1/18∶1）、PC（18∶1/0∶0）和CE（9∶0）濃度為0.5 mg/mL；Chol.濃度為10 mg/mL；其余均為1.0 mg/mL。取不同體積的14種脂質(zhì)類成分標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，混勻后稀釋至1 mL，所有脂質(zhì)類成分的濃度按其在人體血液中的正常濃度配制（少數(shù)成分除外，各脂質(zhì)類成分在人體血液中的正常濃度范圍均由網(wǎng)站HMDB（http：//www.hmdb.ca）獲得），記為Mixture 1。將Mixture 1進(jìn)行10倍、20倍稀釋，即人體血液正常濃度的1/10和1/20倍，分別記為Mixture 2和Mixture 3。

（2）血清樣本：血清在4℃下解凍，取血清30 μL，加入CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）（含0.1 g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基酚，0℃）混合溶劑600 μL，渦旋并靜置，加入水200 μL，離心后移取有機(jī)相氮?dú)獯蹈桑尤胍译?異丙醇（CH3CN-IPA，1∶1， V/V）混合溶劑500 μL復(fù)溶，10000 r/min離心10 min后取上清進(jìn)樣。30例健康人血清分別按以上方法處理后，各取10 μL合并混勻， 即得QC樣本。

2.4 數(shù)據(jù)處理

由RRLC-MS檢測(cè)獲得的QC樣本最初數(shù)據(jù)經(jīng)過Wiff to mzData translator software （version 1.0.0.4， Applied Biosystems/MDS Sciex） 轉(zhuǎn)換成mzData格式。采用XCMS進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)、峰識(shí)別、濾噪、峰匹配，獲得原始二維數(shù)據(jù)陣，進(jìn)一步導(dǎo)入多變量統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA-P software 12.0 （Umetrics AB， Ume， Sweden）進(jìn)行PCA分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 血清樣本前處理方法的建立

首先對(duì)血清樣本中脂質(zhì)類成分的提取方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察。分別采用CHCl3-CH3OH（2∶1， V/V）、CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）、MTBE-CH3OH（4∶1， V/V）3種混合溶劑作為血清樣本中脂質(zhì)類成分的提取溶劑，分別記為CHCl3-CH3OH法、CH2Cl2-CH3OH法、MTBE-CH3OH法，各平行3份。通過對(duì)脂質(zhì)類成分的提取離子流色譜圖峰強(qiáng)度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的考察，分析比較了3種脂質(zhì)類成分提取方法的提取效果，其結(jié)果見圖1及表2。對(duì)于FFA（16∶0）/10.07 min、FFA（18∶2）/7.89 min、PE（14∶0/14∶0）/17.13 min、PC（16∶0/0∶0）/3.71 min、PC（18∶1/0∶0）/4.43min、PC（18∶1/0∶0）/4.58 min、MG（18∶0/0∶0/0∶0）[rac]/10.59 min、Chol./18.1 min等脂質(zhì)類成分，CH2Cl2-CH3OH法的提取離子流色譜圖峰強(qiáng)度高于或明顯高于CHCl3-CH3OH法，其它脂質(zhì)類成分二者近似；對(duì)于FFA（18∶2）/7.89 min、PC（16∶0/0∶0）/3.71 min、PC（16∶0/0∶0）/4.37 min、PC（18∶1/0∶0）/4.58 min、Chol./18.1 min等脂質(zhì)類成分，CH2Cl2-CH3OH法的提取離子流色譜圖峰強(qiáng)度高于或明顯高于MTBE-CH3OH法，其它脂質(zhì)類成分二者近似。而且對(duì)于14種代表性脂質(zhì)類成分，CH2Cl2-CH3OH法RSD小于或近似等于CHCl3-CH3OH法、MTBE-CH3OH法。綜上所述，CH2Cl2-CH3OH法對(duì)于脂質(zhì)類成分的提取效果最優(yōu)，且CH2Cl2的致癌性遠(yuǎn)小于CHCl3 ，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的安全性較高，因此最終采用CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶劑作為血清樣本中脂質(zhì)類成分的提取溶劑。

3.4 數(shù)據(jù)可靠性分析

采用本方法對(duì)大批量血清樣本進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，每分析10個(gè)血清樣本穿插1次QC樣本的檢測(cè)，以QC樣本的重現(xiàn)性監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以保證數(shù)據(jù)的可靠性。圖3是QC樣本的RRLC-MS譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行PCA分析后，各樣本在第一主成分上的投影結(jié)果，12次QC樣本的偏差均在2SD范圍內(nèi)。結(jié)果表明，建立的RRLC-MS分析方法的穩(wěn)定性良好，測(cè)試樣本之間的差異主要來自于樣品中內(nèi)源性代謝物的差異，而不是由分析方法的誤差產(chǎn)生的，因此本研究獲得的檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠、重復(fù)性好，能夠用于脂質(zhì)組學(xué)研究。