摘 要：GB 4789.13-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》已經(jīng)頒布實(shí)施，文章就該標(biāo)準(zhǔn)的修訂部分及修訂原因進(jìn)行詳細(xì)說明，包括樣品制備、選擇性計(jì)數(shù)瓊脂的選擇、活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)、確證實(shí)驗(yàn)和菌數(shù)計(jì)算等方面。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌 檢驗(yàn) 國家標(biāo)準(zhǔn)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，從產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)工作的實(shí)際情況來看，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)與出現(xiàn)的新情況、新問題不相適應(yīng)，主要表現(xiàn)在：原標(biāo)準(zhǔn)的適用性、內(nèi)容的完整性、操作的規(guī)范性等方面還有待進(jìn)一步的提高。中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中國疾病預(yù)防控中心營養(yǎng)與食品安全所和遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局適時地組織和開展對GB/T 4789.13—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》的修訂，修訂后的標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)頒布實(shí)施了。

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clo st ridiu m Perfringens）是引起食源性胃腸炎最常見的病原菌之一，該菌的各種檢測方法對保障食品安全起著非常重要的作用，尤其是食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)就GB 4789.13-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》主要修訂的部分進(jìn)行說明，包括以下5個方面。

1 樣品制備

如樣品采集后不能立即進(jìn)行檢驗(yàn)，以前不知道樣品該如何處理，現(xiàn)在就可以依據(jù)GB 4789.13-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》中5.1樣品制備部分對樣品及時進(jìn)行正確處理。另外，針對固體或半固體樣品的處理，增加了拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)的方法，該方法處理樣品時效率高且效果好。拍擊式均質(zhì)器在微生物檢測領(lǐng)域中已得到廣泛應(yīng)用，在國內(nèi)外許多標(biāo)準(zhǔn)和方法中被推薦使用，及時增加該方法，使用時就有據(jù)可依了。

2 將選擇性計(jì)數(shù)瓊脂由亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS）改為胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂

GB/T 4789.13—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》采用SPS 瓊脂對產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，而US-FDA BAM（USFDA Bacteriological Analytical Manual Chapter 16 Clostridium Perfringens（20 01））、ISO標(biāo)準(zhǔn)（ISO 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs—Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens—Colony-count technique）和AOAC官方方法[AOAC Official Method 976.30：Clostridium Perfringens in Foods Microbiological Method（First Action 1976；Final Action 1979）]均采用TSC瓊脂對產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，所以安排試驗(yàn)比較TSC瓊脂與SPS瓊脂的效果。將國內(nèi)外4個不同品牌的TSC瓊脂與SPS瓊脂進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)菌株的回收率測定實(shí)驗(yàn)，比較不同培養(yǎng)基對產(chǎn)氣莢膜梭菌的靈敏度和特異性。

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124和NCTC8237、雙酶梭菌ATCC638、艱難梭菌ATCC43593及產(chǎn)芽孢梭菌ATCC11437用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供）進(jìn)行活化，36±1℃培養(yǎng)24h，分別吸取1mL上述標(biāo)準(zhǔn)菌株的新鮮培養(yǎng)物，加入含9 mL0.1%蛋白胨水（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供）的試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1∶10的稀釋液。按上述操作，依次制成一系列10倍梯度的均勻稀釋液。選取10-5和10-6稀釋度，分別移取1mL于各個平皿，傾注培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，待凝固后，傾注一層培養(yǎng)基，瓊脂凝固后，正置于36±1℃厭氧培養(yǎng)24h，以厭氧瓊脂為對照計(jì)算回收率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC瓊脂平板上呈黑色菌落，見圖1。結(jié)果表明，國內(nèi)外培養(yǎng)基差異不大，TSC瓊脂的回收率明顯大于SPS瓊脂。

3 活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)中修改了接種方法及培養(yǎng)條件

涂布接種方法一般取0.1mL樣品勻液進(jìn)行接種，接種量較小，誤差對計(jì)數(shù)結(jié)果的影響相對較大，所以采用了傾注計(jì)數(shù)法，其接種量為1mL。但與GB/T 4789.13-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》不同的是，TSC瓊脂凝固后，增加了“用10mL TSC瓊脂覆蓋平板表層”，并將“倒置培養(yǎng)”改為“正置培養(yǎng)”。這樣修改后更有利于產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長，同時有助于獲得黑色菌落的典型形態(tài)，還可有效防止菌落蔓延生長。產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧菌，如果在TSC瓊脂平板表面接種，培養(yǎng)后菌落一般為灰色或無色菌落，不容易得到黑色的典型菌落。

4 確證實(shí)驗(yàn)中將卵磷脂分解試驗(yàn)改為乳糖-明膠試驗(yàn)

發(fā)酵乳糖和液化明膠是產(chǎn)氣莢膜梭菌的兩項(xiàng)重要生物學(xué)特性，ISO標(biāo)準(zhǔn)和AOAC官方方法中，均使用“乳糖-明膠試驗(yàn)”和“動力-硝酸鹽試驗(yàn)”兩組生化試驗(yàn)來進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的確證，說明“乳糖-明膠試驗(yàn)”的重要性。US-FDA BAM中指出，一些巴氏梭菌（C.baratii）也能使含鐵牛乳培養(yǎng)基呈“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，但這些菌乳糖發(fā)酵陰性且能使明膠液化，因此可以通過乳糖-明膠試驗(yàn)加以區(qū)分。US-FDA BAM和AOAC官方方法中均指明少數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的卵磷脂酶較弱或陰性，所以“卵磷脂試驗(yàn)”容易造成假陰性。最終通過多株標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣品添加試驗(yàn)說明了乳糖-明膠試驗(yàn)替代卵磷脂分解試驗(yàn)是非常必要的。

5 菌落計(jì)數(shù)中增加了典型菌落計(jì)數(shù)原則和計(jì)算公式

5.1選擇計(jì)數(shù)平板的范圍由30～300CFU修改為20～200CFU，與US-FDA BAM和AOAC官方方法一致。另外，ISO 7937中計(jì)數(shù)范圍為<150CFU，也遠(yuǎn)小于GB/T4789.13-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》中規(guī)定的范圍。主要原因是產(chǎn)氣莢膜梭菌在平板上生長的菌落較大，縮小計(jì)數(shù)范圍可使計(jì)數(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確，更具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5.2典型菌落計(jì)數(shù)原則參考了GB 4789.10-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的8.4.2。

5 . 3計(jì)算公式則是參考了 GB4789.10-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和GB4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》兩個標(biāo)準(zhǔn)中的計(jì)算公式。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌是采用傾注法培養(yǎng)，接種量為1mL，每個稀釋度需要做兩個平行測定，而且要從典型菌落中挑取10個菌落（不足10個全選）進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，所以本標(biāo)準(zhǔn)同時參考了以上兩個已頒布的標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定了產(chǎn)氣莢膜梭菌計(jì)數(shù)適宜的計(jì)算公式。

以上是GB 4789.13-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》主要修訂的5個方面，有助于對該標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確理解。

參考文獻(xiàn)

[1] US-FDA Bacteriological Analytical Manual Chapter 16 Clostridium Perfringens（2001）.

[2] ISO 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs—Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens—Colony-count technique.

[3] AOAC Official Method 976.30：Clostridium Perfringens in Foods Microbiological Method（First Action 1976；Final Action 1979）.

[4] SN 0177-92 中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn)方法.

[5] GB/T 4789.13-2003中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn).