王國(guó)富，薛士鵬，白麗，吳利先

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

王國(guó)富，薛士鵬，白麗，吳利先

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

目的：構(gòu)建福氏志賀菌重組雙歧桿菌Bb-ipaB疫苗。方法：以福氏志賀菌DNA為模板擴(kuò)增福氏志賀菌ipaB基因，雙酶切后克隆到pGEX-1λT質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-ipaB，電穿孔法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Bb，構(gòu)建福氏志賀菌重組Bb-ipaB疫苗。結(jié)果：成功擴(kuò)增出分子量約為1 711 bp的ipaB基因，雙酶切證實(shí)基因成功插入pGEX-1λT中，并成功轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌，構(gòu)建rBb-ipaB疫苗。結(jié)論：成功構(gòu)建福氏志賀菌重組rBb-ipaB疫苗，為該疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

福氏志賀菌；雙歧桿菌；重組Bb-ipaB疫苗；構(gòu)建

細(xì)菌性痢疾（bacillary dysentery）是由志賀氏菌感染引起的常見(jiàn)腸道急性傳染病，以細(xì)菌侵入腸上皮細(xì)胞引起結(jié)腸化膿性炎癥為主要病變。因此細(xì)菌的侵入是其致病的關(guān)鍵〔1〕。志賀菌胞內(nèi)含有一個(gè)大小為230 kb的毒性質(zhì)粒是其主要致病因子，毒性質(zhì)粒上有31 kb大小的基因片段編碼的侵襲質(zhì)?？乖╥nvasion plasmid antigen，Ipa）是志賀菌致病所必需的〔2〕。Ipa抗原包括四種，分別為A、B、C和D。研究認(rèn)為其中抗原B（IpaB）和C（IpaC）以復(fù)合物形式存在，介導(dǎo)了志賀菌入侵腸上皮細(xì)胞而引起炎癥致病〔3〕。

兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidium，Bb）是一種常見(jiàn)的腸道益生菌。可作為基因工程受體菌能發(fā)揮原有的益生功能外，還能發(fā)揮外源重組特殊基因的功能。因此構(gòu)建重組Bb-ipaB福氏志賀菌疫苗，有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料福氏志賀菌2a 2457T（Nalr）由王恒梁博士惠贈(zèng)，兩歧雙歧桿菌購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保存中心，大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT由李文桂教授惠贈(zèng)。限制性?xún)?nèi)切酶、純化試劑盒和DNA連接試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。電轉(zhuǎn)化儀和電轉(zhuǎn)化杯為Eppendorf產(chǎn)品。PCR儀為PE公司產(chǎn)品。

1.2 目的基因的擴(kuò)增從gene bank中找到ipaB基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物為5'-CC GGATCC ATG AAA GCA AAT AAT C-3'；下游引物為：5'-CC GAATTC TTA TCG GTT TCT-3'由上海生工生物工程公司合成。上游引物引入BamHI的酶切位點(diǎn)，下游引物引入EcoRI的酶切位點(diǎn)。以福氏志賀菌2a 2457T（Nalr）DNA為模板PCR擴(kuò)增ipaB基因，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察并拍照。

1.3 穿梭重組質(zhì)粒pGEX-ipaB的構(gòu)建和鑒定大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭質(zhì)粒pGEX-1λT和福氏志賀菌目的基因ipaB的PCR產(chǎn)物，分別用內(nèi)切酶EcoRI和BHamI進(jìn)行雙酶切并純化，然后將兩種純化產(chǎn)物按試劑盒的比例混合，用T4連接試劑盒在16℃的條件下連接過(guò)夜。連接過(guò)夜后產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21。用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基LA篩選。挑取在LA上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌克隆液體培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒并用限制性酶切和PCR進(jìn)行鑒定。最后上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 雙歧桿菌介導(dǎo)的志賀菌Bb-ipaB疫苗的構(gòu)建和鑒定按參考文獻(xiàn)〔4〕制備Bb的電轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細(xì)菌。取20 μL鑒定好的重組質(zhì)粒pGEX-ipaB與50 μL制備后的Bb感受態(tài)細(xì)菌混勻，冰浴1 min后轉(zhuǎn)移至專(zhuān)用的一次性的Eppendorf電穿孔杯中按參數(shù)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電擊轉(zhuǎn)化完畢后立刻無(wú)菌加入1 mL含0.5 mol/L蔗糖的雙歧桿菌液體培養(yǎng)基，然后將所有液體輕輕移入試管中，在37℃厭氧條件下輕輕震搖培養(yǎng)2 h。最后將液體涂布于含氨芐青霉素的雙歧桿菌固體瓊脂平板上，待菌液吸收后置37℃倒置厭氧培養(yǎng)24～72 h。挑取篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌落，液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增ipaB基因及對(duì)重組質(zhì)粒限制性酶切分析鑒定。

2 結(jié)果

2.1 ipaB基因的擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)PCR擴(kuò)增在1 711 bp左右出現(xiàn)了條帶，見(jiàn)圖1。

圖1 ipaB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-ipaB的鑒定和序列測(cè)定以篩選到的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，所得到的結(jié)果均與預(yù)計(jì)相符，見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-ipaB的鑒定

通過(guò)上述兩種方法鑒定正確的克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果與基因文庫(kù)中的序列相符。從而說(shuō)明福氏志賀菌重組質(zhì)粒pGEX-ipaB已構(gòu)建成功。

2.3 福氏志賀菌重組Bb-ipaB疫苗的鑒定將鑒定正確的上述重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化Bb后，從rBb中提取質(zhì)粒同樣進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，也得到了與大小相符的片段，說(shuō)明重組Bb-ipaB疫苗成功構(gòu)建。

3 討論

目前的研究認(rèn)為，Ⅲ型分類(lèi)系統(tǒng)（TypeⅢsecretion system，T3SS）是包括福氏痢疾桿菌在內(nèi)的諸多G-菌進(jìn)行細(xì)胞侵襲并將毒性蛋白注入宿主細(xì)胞繼而引起炎癥的關(guān)鍵所在。T3SS的核心是由每種細(xì)菌細(xì)胞膜上的基粒和突出于細(xì)胞膜的針尖管狀結(jié)構(gòu)組成〔5-6〕。此外志賀菌的致病性還與細(xì)菌上存在的毒力質(zhì)粒有關(guān)。特別是毒力質(zhì)粒上一個(gè)31 kb大小的基因片段編碼著多種與侵襲相關(guān)的蛋白，包括侵襲性質(zhì)粒蛋白（Invasion plasmid antigen，Ipa）A，B，C，D是志賀菌侵入腸上皮細(xì)胞所必需的〔7-8〕有研究顯示在菌體外，IpaB與IpaC形成可溶性復(fù)合物IpaB-IpaC。此復(fù)合物可與位于上皮細(xì)胞基底面整合素α5β1結(jié)合，從而誘發(fā)了靶細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶活性改變，導(dǎo)致發(fā)生信號(hào)級(jí)聯(lián)放大作用，介導(dǎo)了志賀菌的入侵而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。有研究顯示IpaB蛋白還參與了T3SS侵襲細(xì)胞的調(diào)控，從而介導(dǎo)了疾病的發(fā)生〔9-10〕，因此有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究。

雙歧桿菌是法國(guó)學(xué)者Tissier從母乳營(yíng)養(yǎng)兒的糞便中分離出的一種末端分叉的厭氧革蘭氏陽(yáng)性桿菌，是人體腸道內(nèi)的一種益生菌。其本身可治療慢性腹瀉。有研究顯示通過(guò)用雙歧桿菌對(duì)慢性腹瀉患者臨床觀察研究表明，在服藥兩周以后，患者大便次數(shù)正常，大便形狀異常等臨床癥狀消失，總有效率為90.3%，復(fù)發(fā)率低。用雙歧桿菌作為制備福氏志賀菌疫苗的活載體具有許多優(yōu)點(diǎn)：首先，所表達(dá)的靶基因ipaB不需要進(jìn)行體外純化，可直接用于免疫接種，這樣就免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序；其次，單次接種即可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的免疫反應(yīng)，而且具有粘膜佐劑的作用，這樣就免除了添加佐劑帶來(lái)的副作用；另外，運(yùn)用分子生物學(xué)手段，通過(guò)對(duì)不同靶抗原的剪切和拼接，還可使新型疫苗理想化。更重要的是這種載體價(jià)格低廉，適于大量生產(chǎn)，更容易被接受和認(rèn)可。因此本研究構(gòu)建福氏志賀菌Bb-ipaB疫苗，用于福氏志賀菌及其相關(guān)疾病的預(yù)防具有廣闊的應(yīng)用前景。

〔1〕Menard R，Dehio C，Sansonetti P J.Bacterial entery into epithelial cells：the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996，4（6）：220-226.

〔2〕Sasakawa C，Kamata K，Sakai T，et a1．Virulence-assosiated geneticregionscomprising31kilobases ofthe230．kilobaseplamaid in Shigella flexneri 2a〔J〕．J Bacteriol，1998，170：2480-2484．

〔3〕Menard R，Dehio C，Sansonetti P J.Bacterial entery into epithelial cells；the paradigm of Shigellosis〔J〕.Trends Microbiol，1996，4：220-226.

〔4〕王國(guó)富，高峰，吳利先.幽門(mén)螺桿菌重組Bb-hpaA-vacA疫苗的構(gòu)建〔J〕.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（2）：131-134.

〔5〕Sani M，Botteaux A，Parsot C，et al.IpaD is localized at the tip of the Shigella flexneri type III secretion apparatus〔J〕. Biochim Biophys Acta，2007，1770（2）：307-311.

〔6〕Hamiaux C，Van E A，Parsot C，et al.Structural mimicry for vinculin activation by IpaA，a virulence factor of Shigella flexneri〔J〕.EMBO Rep，2006，7（8）：794-799.

〔7〕Ramarao N，Le C C，Izard T，et al.Capping of actin filaments by vinculin activated by the Shigella IpaA carboxyl-terminal domain〔J〕.FEBS Lett，2007，581（5）853-857.

〔8〕Sansonetti P J.Microbes and Microbial Toxin：Parardigms for Microbial-Mucosal InteractinsⅢShigellosis：from symptoms to molecular pathogenesis〔J〕.Am J Physiol Gastointest Liver Physiol，2001，280（3）：319-323.

〔9〕Lunelli M，Lokareddy R K，Zychlinsky A，et al.IpaB-IpgC interaction defines binding motif for type III secretion translocator〔J〕.Biological Chemistry，2008，283：18646-18654.

〔10〕Shen D K，Saurya S，Wagner C，et al.Domains of the Shigella flexneri Type III Secretion System IpaB Protein Involved in Secretion Regulation.American Society for Microbiology〔J〕.Infect Immun，2010，78（12）：4999-5010.

（責(zé)任編輯 董杰）

Construction of the Recombinant Bb-ipaB Vaccine of Shigella flexneri

WANG Guofu,XUE Shipeng,BAI Li,WU Lixian
（Pre-clinical College,Dali University，Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To construct the recombinant Bb-ipaB vaccine of Shigella flexneri.Methods：ipaB gene was amplified by PCR and cloned into pGEX-1λT plasmid to construct pGEX-ipaB.The recombinant plasmid was electroporated into Bifidobacteria bifidum（Bb）to construct rBb-ipaB vaccine.Results：A 1 711 bp gene of ipaB was successfully amplified by PCR and cloned into pGEX-1λT by restriction analysis,and the rBb-ipaB vaccine was successfully constructed by PCR and restriction analysis.Conclusion：The rBbipaB vaccine of Shigella flexneri is successfully constructed,which lays the experimental foundation of exploitation and utilization of this vaccine.

Shigella flexneri；Bifidobacterium bifidum；recombinant Bb-ipaB vaccine;construction

R378.2+5

A

1672-2345（2013）03-0013-03

云南省教育廳基金重點(diǎn)項(xiàng)目基金資助項(xiàng)目（09Z0078）

2012-12-24

王國(guó)富，副教授，主要從事細(xì)菌疫苗研究.