支玉香，劉宏俠，徐迎陽，張宏譽(yù)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京 100730)

C1抑制物(C1 inhibitor，C1 INH)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，其作為一種抑制因子在補(bǔ)體系統(tǒng)、激肽原酶-激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)中發(fā)揮作用[1]。C1 INH的含量和(或)功能缺乏會(huì)導(dǎo)致以上諸系統(tǒng)的過度活化，尤其在激肽系統(tǒng)中，由于激肽釋放酶的過度活化，導(dǎo)致緩激肽水平升高，臨床上表現(xiàn)為局限性血管水腫。遺傳性血管水腫(Hereditary angioedema，HAE)也屬于C1 INH缺乏癥，是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率為150 000～110 000[2-3]。臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)生的皮膚黏膜水腫，腸道水腫時(shí)，可引起劇烈腹痛；上呼吸道水腫，可致窒息甚至死亡。由于HAE發(fā)病率低，臨床上易發(fā)生誤診、誤治。該疾病的診斷除需要了解家族史和根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)外，主要依賴于實(shí)驗(yàn)室對(duì)C1 INH功能活性的檢測(cè)。

近年來，國外較多推薦采用比色法對(duì)C1 INH的功能進(jìn)行檢測(cè)。北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科實(shí)驗(yàn)室率先在國內(nèi)引進(jìn)了該檢測(cè)方法，現(xiàn)已建立了我國健康人的正常值范圍，并對(duì)標(biāo)本的儲(chǔ)存溫度和時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響及其在HAE診斷中的敏感性和特異性進(jìn)行了評(píng)估，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

對(duì)象和方法

對(duì)象

受試者為2010年至2012年于北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科門診已明確診斷為HAEⅠ型患者21例，男10例，女11例，平均年齡32.9歲。診斷依據(jù)：血管水腫家族史；臨床表現(xiàn)為皮膚及黏膜水腫；C1 INH濃度及C4水平均低于正常。健康對(duì)照者為2012年北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心的65名健康體檢者，均無水腫史且家族中無血管水腫患者，血尿常規(guī)、肝腎功能、心電圖及胸X線檢查均正常。男35例，女30例，平均年齡33.4歲。

C1 INH功能檢測(cè)方法及試劑

所有健康對(duì)照者和HAE患者均抽取靜脈血2 ml，溶于含有0.109 molL的枸櫞酸鈉抗凝管中(比例為9∶1)，立即3 000 rmin離心15 min，用玻璃管收集血漿。按試劑說明書方法進(jìn)行檢測(cè)：(1)用緩沖液A將血漿樣本及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋(比例為1∶11)。(2)將底物C1-1與緩沖液B混合(1∶4)，37℃預(yù)熱。(3)取稀釋的樣本及標(biāo)準(zhǔn)品0.1 ml與0.1 ml的C1酯酶混合，37℃水浴5 min。(4)每份加入底物-緩沖液混合物0.6 ml，37℃水浴3 min。(5)加入50%的乙酸0.2 ml終止反應(yīng)。(6)波長405 nm，光路10 mm，以空氣作空白對(duì)照檢測(cè)吸光度值。(7)C1 INH的活性為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取待檢樣本的C1 INH的功能活性。C1 INH功能檢測(cè)試劑盒由奧地利Immno Chrom公司提供，試劑包括底物C1-1(C2H5CO-Lys-Gly-Arg-Pna)、C1 酯酶、標(biāo)準(zhǔn)品及緩沖液A和B。

敏感性和特異性

為了評(píng)估該檢測(cè)方法對(duì)HAE診斷的敏感性和特異性，對(duì)所有受試者進(jìn)行C1 INH功能活性檢測(cè)后，根據(jù)HAE患者陽性檢測(cè)樣本占HAE患者總數(shù)的百分比計(jì)算得出敏感性，根據(jù)健康對(duì)照者中陰性檢測(cè)的樣本占健康對(duì)照者總數(shù)的百分比得出特異性。

影響因素分析

為了評(píng)估血液標(biāo)本的儲(chǔ)存條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，對(duì)9名健康對(duì)照者進(jìn)行了研究。每名健康對(duì)照者抽取靜脈血2 ml，血漿的收集方法與前相同，但將每份血漿分成9組，分別儲(chǔ)存于室溫(25℃～31℃)3組，4℃ 3組，-20℃ 3組，然后分別于收集血漿后立即、4、8和24 h檢測(cè)C1 INH的功能活性，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS軟件對(duì)HAE患者和健康對(duì)照者的C1INH功能活性檢測(cè)值的差異及不同儲(chǔ)存條件下C1INH的功能活性差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C1 INH功能活性值用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

結(jié)　　果

健康對(duì)照者正常范圍和HAE患者的C1 INH功能檢測(cè)值

經(jīng)過3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

65例健康對(duì)照者C1 INH功能活性值為(1.07±0.26)U C1 INHml(1U C1 INH相當(dāng)于1 ml正常新鮮血漿中的C1 INH的功能活性)。因該組數(shù)值呈正態(tài)分布，因此確立該檢測(cè)方法的正常值為(1.07±1.96×0.26)，即(0.56～1.58)Uml。21例HAE患者的C1 INH功能活性值為(0.11±0.12) U C1 INHml，與健康對(duì)照者相比，具有顯著差異(P<0.001)(圖2)。

圖1C1 INH功能活性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig1Functional C1 INH testing standard curve

C1 INH：C1抑制物

敏感性和特異性

65例健康對(duì)照者中，所有檢測(cè)結(jié)果均在正常范圍；21例HAE患者的C1 INH功能活性均明顯低于正常。該檢測(cè)方法的特異性(65/65)和敏感性(21/21)均為100%。

影響因素

同一組樣品保存于室溫和4℃中，隨著保存時(shí)間的延長，C1 INH的功能活性呈逐漸下降趨勢(shì)，而且保存溫度越高，下降趨勢(shì)越為明顯。而保存于-20℃，對(duì)檢測(cè)結(jié)果無影響(圖3)。

保存24 h時(shí)，室溫、4℃、-20℃的C1 INH功能活性相比較，差異有顯著性(F=5.038，P<0.05)；保存4 h和8 h時(shí)，室溫、4℃、-20℃的C1 INH功能活性相比較，差異均無顯著性(F分別為0.787及1.710，均P>0.05)。

討　　論

C1 INH是一種高度糖基化的單鏈多肽，由478個(gè)氨基酸殘基組成[4]，相對(duì)分子質(zhì)量為105 000，血漿濃度為240 mg/L，相當(dāng)于1 U/ml，健康人的C1INH半衰期為28 h[5]，其底物為C1s、C1r、αFⅫa、βFⅫa、激肽釋放酶、FⅪa、纖維蛋白溶酶、MASP-1及MASP-27。因其在多系統(tǒng)中發(fā)揮抑制作用，所以C1 INH缺乏會(huì)導(dǎo)致多種內(nèi)源性介質(zhì)釋放，引起局部炎性反應(yīng)。這些介質(zhì)來源于激肽原酶-激肽系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)，而C1 INH對(duì)這些系統(tǒng)的活化具有抑制作用，因此認(rèn)為C1 INH具有抗炎作用[6]。C1 INH濃縮劑已廣泛用于HAE急性發(fā)作期的治療及緩解期的預(yù)防[7]。

HAE發(fā)病的分子機(jī)制是C1 INH基因突變導(dǎo)致C1 INH功能缺乏。一方面可能是C1 INH的蛋白含量降低進(jìn)而導(dǎo)致功能缺陷(HAEⅠ型)，約85%的患者屬于該類型；另一方面也可能是合成了無功能的C1 INH蛋白(HAEⅡ型)，此種情況C1 INH的濃度正?；蛘咻p微升高，但C1 INH的功能低下，約15%的患者屬于該類型[8]?？梢?，無論HAEⅠ型還是Ⅱ型，C1 INH功能檢測(cè)在HAE診斷中都起著至關(guān)重要的作用。

目前商業(yè)化的C1INH 功能檢測(cè)方法有兩種，一種是采用比色法檢測(cè)C1 INH的功能活性。本方法的原理是將血漿標(biāo)本加入過量的C1酯酶中，形成C1酯酶-C1 INH復(fù)合物，然后加入染色底物C1-1(C2H5CO-Lys-Gly-Arg-Pna)，與剩余的C1酯酶發(fā)生反應(yīng)，通過檢測(cè)吸光度得到C1 INH的功能活性。C1-1與C1酯酶具有更高的親和性，只需要較少的C1酯酶和血漿，即可精確檢測(cè)C1 INH的功能活性。另一種方法即采用酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)C1 INH的功能活性。該方法是先將血漿標(biāo)本與生物素標(biāo)記的C1s孵育，形成C1 INH-C1s復(fù)合物，然后加入抗人的C1 INH抗體與之反應(yīng)檢測(cè)C1 INH的功能活性。

研究表明這兩種方法對(duì)診斷HAE 均具有較高的敏感性和特異性[9]。目前，比色法的臨床應(yīng)用更為廣泛，因其受治療影響較小，因此更適用于診斷，但對(duì)標(biāo)本的保存溫度和時(shí)間要求較高[10]；而采用酶聯(lián)免疫分析法易受治療的影響，因此更常用于監(jiān)測(cè)療效。本研究對(duì)比色法在我國健康對(duì)照者中的正常范圍及在HAE診斷中的敏感性和特異性進(jìn)行分析，結(jié)果表明該方法對(duì)HAE的診斷具有極高的敏感性和特異性，與既往研究結(jié)果相似[11]。而且，由于研究者在行敏感性和特異性研究時(shí)，不論是健康對(duì)照者還是患者標(biāo)本，均為采集標(biāo)本后立即檢測(cè)，因此減少了標(biāo)本保存溫度和時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響，使得敏感性和特異性更準(zhǔn)確。

為了更加精確地檢測(cè)C1 INH功能活性，為臨床診斷HAE提供更加可靠的依據(jù)，本研究就樣本的存放溫度和時(shí)間對(duì)C1 INH功能活性的影響進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，無論以室溫還是4℃保存，如達(dá)到24 h，C1 INH的功能活性均明顯下降，但保存于-20℃，則無下降；雖然在室溫和4℃保存4 h和8 h，與保存-20℃相比差異無顯著性，但從結(jié)果看，也有不同程度的下降，且保存時(shí)間越長，溫度越高，下降幅度越大。Ineke等[10]曾對(duì)C1 INH功能檢測(cè)的影響因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明健康對(duì)照者的樣本在室溫保存2 h后輕微下降；在-20℃儲(chǔ)存長達(dá)16 d，C1 INH功能活性依然無變化。有研究對(duì)HAE患者血漿和健康人的血漿標(biāo)本進(jìn)行了比較，結(jié)果表明室溫及4℃保存相同時(shí)間，HAE患者的C1 INH功能活性下降的更為明顯[10,12]，表明標(biāo)本的儲(chǔ)存溫度和時(shí)間對(duì)HAE患者C1 INH功能活性的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)健康人的影響。

可見，比色法檢測(cè)C1 INH功能活性對(duì)HAE的診斷具有極高的敏感性和特異性，但受標(biāo)本儲(chǔ)存條件的影響較大。因此，建議采血后立即分離血漿進(jìn)行檢測(cè)或于-20℃保存24 h或以內(nèi)檢測(cè)，否則可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

(本文圖2、3見插頁第Ⅳ頁)

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