張志偉，侯玉濤，何素輝，鄺珠芳，陳章權#

(1.廣東醫(yī)學院廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，東莞 523808；2.廣東醫(yī)學院臨床免疫學教研室，東莞 523808；3.廣東醫(yī)學院門診部，東莞 523808)

肥大細胞是多功能細胞，其內的炎性介質對功能的發(fā)揮具有重要作用。肥大細胞炎性介質主要分為預先合成和新合成兩種介質，其中中性蛋白酶是一類重要的預先合成介質，其主要成分之一的肥大細胞類糜蛋白酶(mast cell chymase，MC-Chy)是一種絲氨酸蛋白酶，在過敏性疾病、動脈粥樣硬化、心肌梗死、腫瘤、肺纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的病理生理作用[1-2]。近年來研究表明，MC-Chy與腫瘤的血管生成有關[3]。本實驗應用基質膠栓(Matrigel plug)血管生成模型對人MC-Chy的促血管生成作用進行研究。

材料和方法

材料

人MC-Chy分泌型真核表達質粒DNA由廣東醫(yī)學院廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室構建[4]?；|膠(BD MatrigelTMBasement Membrane Matrix High Concentration)購自BD公司。糜蛋白酶抑制劑(chymostatin，CHI)及類糜蛋白酶檢測試劑盒(Chymase Assay Kit)購自sigma公司。無內毒素質粒大提試劑盒購自北京TIANGEN公司。兔抗CD34抗體、免疫組化檢測試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。血紅蛋白(hemoglobin，Hb)測定文齊氏液購自天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所。BALBc小鼠由廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供。

方法

MC-Chy活性測定：上述離心收集上清，加入0.05%的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，采用Chymase Assay Kit進行酶活性檢測，具體操作步驟按說明書進行。

HE染色：一半基質膠栓組織經4%甲醛固定后常規(guī)包埋切片，脫蠟后，蘇木精染色液染色8 min，沖洗后分化液分化30 s，溫水浸泡5 min，伊紅復染，自來水沖洗，常規(guī)脫水，透明，中性樹脂封片。

免疫組織化學染色：采用CD34作為血管內皮細胞的標記物，對基質膠栓組織的新生血管內皮細胞進行免疫組織化學染色，采用鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)三步法，步驟主要如下：切片脫蠟后，采用0.4%胃蛋白酶(用0.1 molL鹽酸配制)修復抗原，3%過氧化氫去離子水去除內源性過氧化物酶，常規(guī)封閉后加兔抗CD34多克隆抗體(一抗)，孵育洗滌后加生物素化的山羊抗兔IgG(二抗)，孵育洗滌后加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素工作液(酶液)，孵育洗滌后加二氨基聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液顯色，水洗終止顯色，蘇木素復染、沖洗、脫水、透明、封片。

MVD測量：用免疫組織化學法對血管內皮細胞CD34分子進行染色后，進行血管密度計數(shù)，方法參照文獻[6]。被抗CD34抗體染成棕黃色的內皮細胞或內皮細胞簇，只要與其他結締組織成分有明顯區(qū)別，無論有無管腔，均作為1個微血管計數(shù)。在100倍光鏡下掃查整個切片，尋找血管高密度區(qū)，再在高倍鏡(400倍)下記數(shù)10個視野被染成棕黃色的血管數(shù)，每個高倍鏡視野(high power objective，HP)的面積為150 μm×100 μm，取其平均值作為微血管密度。以上的測量過程由帶有New OsteoMeasure圖像分析軟件的成像分析系統(tǒng)進行。

統(tǒng)計學分析

結　　果

Hb濃度

Chy50組、Chy100組、Chy150組、Chy200組與對照組比較均存在顯著性差異。注射不同劑量的質粒DNA的實驗組之間比較，除Chy150組與Chy200之間差異不存在顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其他各組之間均存在顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑制劑組的Hb含量檢測結果與對照組相比差異無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

基質膠栓組織中MC-Chy活性測定

陽性對照為試劑盒內提供的MC-Chy，可見酶作用曲線迅速上升且很快，約20 min達到平衡期。陽性對照加CHI后，其反應曲線與只加生理鹽水的陰性對照基本相同。Chy100組的MC-Chy反應的光密度(optical density，OD)值持續(xù)上升，但上升速度較陽性對照慢，且1.5 h后仍有上升。Chy100組加CHI后，則檢測不出酶反應，酶反應被完全抑制(圖1)。實驗中發(fā)現(xiàn)，其他各濃度的實驗組得到與Chy100組相似的結果。

表1基質膠栓組織中血紅蛋白含量測定(mgg濕組織)

組別血紅蛋白含量對照組2 9±0 7抑制劑組2 1±0 8Chy50組7 5±1 4?Chy100組21 7±2 7#Chy150組28 4±2 1#Chy200組25 8±2 0#

與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

HE染色

對照組偶見少量散在的小血管。4組實驗組均可以看到較多的血管；隨著MC-Chy質粒DNA注射劑量的增加，其血管數(shù)目增加；但當注射的質粒DNA劑量超過150 μg后，血管數(shù)則未見明顯增加。抑制劑組未見到新生血管(圖2)。

免疫組織化學染色

對照組偶見有散在的棕黃色陽性顆粒，抑制劑組未見棕黃色陽性顆粒。實驗組均可看到較多的棕黃色陽性顆粒及粗大的血管腔；隨著MC-Chy質粒DNA注射劑量的增加，陽性程度不斷增加，但當MC-Chy質粒DNA的注射劑量超過150 μg后，則未見明顯增加(圖3)。

MVD測量

Chy50組、Chy100組、Chy150組、Chy200組與對照組比較，均存在顯著性差異(P<0.01)。實驗組中各組間比較，隨著MC-Chy質粒DNA注射劑量的增加，MVD值則上升，但Chy100組與Chy200組之間、Chy150組與Chy200組間不存在顯著性差異(P>0.05)。抑制劑組與對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

圖1　基質膠栓類糜蛋白酶活性測定結果Fig 1　The detection of chymase activity in matrigel plug　　　CHI：糜蛋白酶抑制劑

表2膠體組織血管密度計數(shù)(血管數(shù)HP)
Table2Count of MVD in matrigel plug (microvessel numberHP)

組別Hb含量對照組5 9±2 7抑制劑組3 8±1 7Chy50組9 3±2 7#Chy100組12 2±4 0#Chy150組15 4±3 1#Chy200組13 5±3 6#

與對照組比較，#P<0.01

討　　論

肥大細胞不僅在變態(tài)反應性疾病中起著至關重要的作用，在免疫應答及血管生成、組織重塑、傷口愈合、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面也起著重要作用[7-8]。肥大細胞作用的發(fā)揮主要依賴于細胞活化并產生和釋放炎性介質，MC-Chy是其中重要的細胞內預先合成介質。近年來，MC-Chy與腫瘤的血管生成有關[3]，但具體機制尚未完全清楚。

研究血管生成作用的實驗模型有多種，主要有體內模型和體外模型兩大類?；|膠栓模型是一種新的體內模型，該模型利用了基質膠在4℃時維持液態(tài)，在室溫以上溫度時迅速凝結成膠的特點進行。由于天然的人MC-Chy難于獲取，本實驗采用體內基質膠栓血管生成模型的方法，將人MC-Chy真核表達質粒轉染入動物體內，在體內表達MC-Chy的方法來研究其在血管生成中的作用[5-6]。通過Hb濃度及MVD的定量測定，結果發(fā)現(xiàn)人MC-Chy真核表達質粒DNA注射實驗組與生理鹽水對照組比較均存在顯著性差異(P<0.05)，顯示人MC-Chy具有明顯的促血管生成作用。HE和免疫組織化學染色結果也顯示抑制劑組未見到新生血管，而實驗組則見有顯明的新生血管。因此，本實驗結果表明人MC-Chy具有明顯的促血管生成作用，為進一步研究人MC-Chy的促血管新生在腫瘤及其他疾病發(fā)生發(fā)展中的病理生理作用奠定了基礎。

(本文圖2、3見插頁第Ⅲ頁)

[1]Pejler G, Ronnberg E, Waern I, et al. Mast cell proteases： multifaceted regulators of inflammatory disease[J]. Blood, 2010, 115：4981-4890.

[2]Bacani C, Frishman WH. Chymase： a new pharmacologic target in cardiovascular disease[J]. Cardiol Rev, 2006, 14：187-193.

[3]Kondo K, Muramatsu M, Okamoto Y, et al. Expression of chymase-positive cells in gastric cancer and its correlation with the angiogenesis[J]. J Surg Oncol, 2006, 93：36-42.

[4]唐曉磊, 何素輝, 梁曉東, 等. 人肥大細胞類糜蛋白酶分泌型真核表達載體的構建[J]. 山東醫(yī)藥, 2010：23-25.

[5]Murray JC. Angiogenesis protocols[J]. Humana Pr Inc, 2001, 46：45-50.

[6]Muramatsu M, Katada J, Hayashi I, et al. Chymase as a proangiogenic factor. A possible involvement of chymase-angiotensin-dependent pathway in the hamster sponge angiogenesis model[J]. J Biol Chem, 2000, 275：5545-5552.

[7]Kondo K, Muramatsu M, Okamoto Y, et al. Expression of chymase-positive cells in gastric cancer and its correlation with the angiogenesis[J]. Surg Oncol, 2006, 93：36-42.

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