張志偉，侯玉濤，何素輝，鄺珠芳，陳章權(quán)#

(1.廣東醫(yī)學(xué)院廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808；2.廣東醫(yī)學(xué)院臨床免疫學(xué)教研室，東莞 523808；3.廣東醫(yī)學(xué)院門診部，東莞 523808)

肥大細(xì)胞是多功能細(xì)胞，其內(nèi)的炎性介質(zhì)對(duì)功能的發(fā)揮具有重要作用。肥大細(xì)胞炎性介質(zhì)主要分為預(yù)先合成和新合成兩種介質(zhì)，其中中性蛋白酶是一類重要的預(yù)先合成介質(zhì)，其主要成分之一的肥大細(xì)胞類糜蛋白酶(mast cell chymase，MC-Chy)是一種絲氨酸蛋白酶，在過(guò)敏性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、腫瘤、肺纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的病理生理作用[1-2]。近年來(lái)研究表明，MC-Chy與腫瘤的血管生成有關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基質(zhì)膠栓(Matrigel plug)血管生成模型對(duì)人MC-Chy的促血管生成作用進(jìn)行研究。

材料和方法

材料

人MC-Chy分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒DNA由廣東醫(yī)學(xué)院廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[4]?；|(zhì)膠(BD MatrigelTMBasement Membrane Matrix High Concentration)購(gòu)自BD公司。糜蛋白酶抑制劑(chymostatin，CHI)及類糜蛋白酶檢測(cè)試劑盒(Chymase Assay Kit)購(gòu)自sigma公司。無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN公司。兔抗CD34抗體、免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司。HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。血紅蛋白(hemoglobin，Hb)測(cè)定文齊氏液購(gòu)自天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所。BALBc小鼠由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

方法

MC-Chy活性測(cè)定：上述離心收集上清，加入0.05%的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，采用Chymase Assay Kit進(jìn)行酶活性檢測(cè)，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

HE染色：一半基質(zhì)膠栓組織經(jīng)4%甲醛固定后常規(guī)包埋切片，脫蠟后，蘇木精染色液染色8 min，沖洗后分化液分化30 s，溫水浸泡5 min，伊紅復(fù)染，自來(lái)水沖洗，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)脂封片。

免疫組織化學(xué)染色：采用CD34作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物，對(duì)基質(zhì)膠栓組織的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)三步法，步驟主要如下：切片脫蠟后，采用0.4%胃蛋白酶(用0.1 molL鹽酸配制)修復(fù)抗原，3%過(guò)氧化氫去離子水去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，常規(guī)封閉后加兔抗CD34多克隆抗體(一抗)，孵育洗滌后加生物素化的山羊抗兔IgG(二抗)，孵育洗滌后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液(酶液)，孵育洗滌后加二氨基聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫溶液顯色，水洗終止顯色，蘇木素復(fù)染、沖洗、脫水、透明、封片。

MVD測(cè)量：用免疫組織化學(xué)法對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34分子進(jìn)行染色后，進(jìn)行血管密度計(jì)數(shù)，方法參照文獻(xiàn)[6]。被抗CD34抗體染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要與其他結(jié)締組織成分有明顯區(qū)別，無(wú)論有無(wú)管腔，均作為1個(gè)微血管計(jì)數(shù)。在100倍光鏡下掃查整個(gè)切片，尋找血管高密度區(qū)，再在高倍鏡(400倍)下記數(shù)10個(gè)視野被染成棕黃色的血管數(shù)，每個(gè)高倍鏡視野(high power objective，HP)的面積為150 μm×100 μm，取其平均值作為微血管密度。以上的測(cè)量過(guò)程由帶有New OsteoMeasure圖像分析軟件的成像分析系統(tǒng)進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

Hb濃度

Chy50組、Chy100組、Chy150組、Chy200組與對(duì)照組比較均存在顯著性差異。注射不同劑量的質(zhì)粒DNA的實(shí)驗(yàn)組之間比較，除Chy150組與Chy200之間差異不存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其他各組之間均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。抑制劑組的Hb含量檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

基質(zhì)膠栓組織中MC-Chy活性測(cè)定

陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒內(nèi)提供的MC-Chy，可見(jiàn)酶作用曲線迅速上升且很快，約20 min達(dá)到平衡期。陽(yáng)性對(duì)照加CHI后，其反應(yīng)曲線與只加生理鹽水的陰性對(duì)照基本相同。Chy100組的MC-Chy反應(yīng)的光密度(optical density，OD)值持續(xù)上升，但上升速度較陽(yáng)性對(duì)照慢，且1.5 h后仍有上升。Chy100組加CHI后，則檢測(cè)不出酶反應(yīng)，酶反應(yīng)被完全抑制(圖1)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其他各濃度的實(shí)驗(yàn)組得到與Chy100組相似的結(jié)果。

表1基質(zhì)膠栓組織中血紅蛋白含量測(cè)定(mgg濕組織)

組別血紅蛋白含量對(duì)照組2 9±0 7抑制劑組2 1±0 8Chy50組7 5±1 4?Chy100組21 7±2 7#Chy150組28 4±2 1#Chy200組25 8±2 0#

與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

HE染色

對(duì)照組偶見(jiàn)少量散在的小血管。4組實(shí)驗(yàn)組均可以看到較多的血管；隨著MC-Chy質(zhì)粒DNA注射劑量的增加，其血管數(shù)目增加；但當(dāng)注射的質(zhì)粒DNA劑量超過(guò)150 μg后，血管數(shù)則未見(jiàn)明顯增加。抑制劑組未見(jiàn)到新生血管(圖2)。

免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組偶見(jiàn)有散在的棕黃色陽(yáng)性顆粒，抑制劑組未見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性顆粒。實(shí)驗(yàn)組均可看到較多的棕黃色陽(yáng)性顆粒及粗大的血管腔；隨著MC-Chy質(zhì)粒DNA注射劑量的增加，陽(yáng)性程度不斷增加，但當(dāng)MC-Chy質(zhì)粒DNA的注射劑量超過(guò)150 μg后，則未見(jiàn)明顯增加(圖3)。

MVD測(cè)量

Chy50組、Chy100組、Chy150組、Chy200組與對(duì)照組比較，均存在顯著性差異(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組中各組間比較，隨著MC-Chy質(zhì)粒DNA注射劑量的增加，MVD值則上升，但Chy100組與Chy200組之間、Chy150組與Chy200組間不存在顯著性差異(P>0.05)。抑制劑組與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

圖1　基質(zhì)膠栓類糜蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果Fig 1　The detection of chymase activity in matrigel plug　　　CHI：糜蛋白酶抑制劑

表2膠體組織血管密度計(jì)數(shù)(血管數(shù)HP)
Table2Count of MVD in matrigel plug (microvessel numberHP)

組別Hb含量對(duì)照組5 9±2 7抑制劑組3 8±1 7Chy50組9 3±2 7#Chy100組12 2±4 0#Chy150組15 4±3 1#Chy200組13 5±3 6#

與對(duì)照組比較，#P<0.01

討　　論

肥大細(xì)胞不僅在變態(tài)反應(yīng)性疾病中起著至關(guān)重要的作用，在免疫應(yīng)答及血管生成、組織重塑、傷口愈合、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面也起著重要作用[7-8]。肥大細(xì)胞作用的發(fā)揮主要依賴于細(xì)胞活化并產(chǎn)生和釋放炎性介質(zhì)，MC-Chy是其中重要的細(xì)胞內(nèi)預(yù)先合成介質(zhì)。近年來(lái)，MC-Chy與腫瘤的血管生成有關(guān)[3]，但具體機(jī)制尚未完全清楚。

研究血管生成作用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀卸喾N，主要有體內(nèi)模型和體外模型兩大類?；|(zhì)膠栓模型是一種新的體內(nèi)模型，該模型利用了基質(zhì)膠在4℃時(shí)維持液態(tài)，在室溫以上溫度時(shí)迅速凝結(jié)成膠的特點(diǎn)進(jìn)行。由于天然的人MC-Chy難于獲取，本實(shí)驗(yàn)采用體內(nèi)基質(zhì)膠栓血管生成模型的方法，將人MC-Chy真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入動(dòng)物體內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)MC-Chy的方法來(lái)研究其在血管生成中的作用[5-6]。通過(guò)Hb濃度及MVD的定量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人MC-Chy真核表達(dá)質(zhì)粒DNA注射實(shí)驗(yàn)組與生理鹽水對(duì)照組比較均存在顯著性差異(P<0.05)，顯示人MC-Chy具有明顯的促血管生成作用。HE和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也顯示抑制劑組未見(jiàn)到新生血管，而實(shí)驗(yàn)組則見(jiàn)有顯明的新生血管。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人MC-Chy具有明顯的促血管生成作用，為進(jìn)一步研究人MC-Chy的促血管新生在腫瘤及其他疾病發(fā)生發(fā)展中的病理生理作用奠定了基礎(chǔ)。

(本文圖2、3見(jiàn)插頁(yè)第Ⅲ頁(yè))

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