蔡培培，尹　佳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科 協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 100730)

小麥?zhǔn)侵饕r(nóng)作物之一，人類加工并消耗，在此過程中小麥過敏也隨之出現(xiàn)[1]。根據(jù)對過敏原暴露的路徑和潛在的免疫機(jī)制，小麥過敏可分為經(jīng)典食物過敏(影響皮膚、胃腸道或呼吸道)、食物依賴運(yùn)動誘發(fā)嚴(yán)重過敏反應(yīng)(food-dependent exercise-induced anaphylaxis， FDEIA)、職業(yè)性哮喘即所謂的面包師哮喘(baker’s asthma，BA)及接觸性蕁麻疹[2]。瑞典的調(diào)查顯示，小麥誘發(fā)的食物過敏在兒童的發(fā)生率為4%[2]；美國的研究認(rèn)為，小麥誘發(fā)的食物過敏在成人的發(fā)生率為0.4%[2]。針對韓國某大型面包工廠的問卷調(diào)查顯示，BA的發(fā)生率為1.53%[3]。截至目前，小麥誘發(fā)的FDEIA和接觸性蕁麻疹的流行病學(xué)數(shù)據(jù)尚未見有研究發(fā)表，小麥誘發(fā)的FDEIA罕見，其發(fā)生率可能較低。小麥蛋白是小麥過敏的過敏原。小麥蛋白分為水溶性蛋白和非水溶性蛋白，水溶性蛋白包括清蛋白(albumins)和球蛋白(globulins)；非水溶性蛋白包括醇溶蛋白(gliadins)和谷蛋白(glutenins)，醇溶蛋白和谷蛋白聯(lián)合稱麥膠蛋白(gluten)[4]。小麥醇溶蛋白分為α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白，其中ω-醇溶蛋白被細(xì)分為慢-ω-醇溶蛋白(ω-1、ω-2)和快-ω-醇溶蛋白(ω-5)兩種類型，ω-5-醇溶蛋白是導(dǎo)致小麥依賴運(yùn)動誘發(fā)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis，WDEIA)發(fā)生的主要致敏蛋白[1]。

小麥過敏是一種多因子疾病，即由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而致其發(fā)生。目前，對多因子疾病的遺傳因素研究一般通過遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究實(shí)現(xiàn)。根據(jù)所研究的病種，選擇具代表性的單核苷酸多態(tài)性(single nuclear polymorphism，SNP)位點(diǎn)，在遵循Hardy-Weinberg平衡定律的基礎(chǔ)上研究SNP與多因子疾病的相關(guān)性。關(guān)聯(lián)研究的經(jīng)典模式是病例-對照研究，即通過比較等位基因頻率或基因型頻率在疾病組與對照組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異闡明基因多態(tài)性位點(diǎn)與表型的相關(guān)性[5]。

本研究采用SNP分型為基礎(chǔ)的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究，對小麥過敏的遺傳因素進(jìn)行部分闡述。從小麥過敏的發(fā)生機(jī)制著手，確定2個細(xì)胞因子基因的SNP——FCER1B基因rs569108和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)基因rs324015位點(diǎn)，分析這2個SNP的基因型頻率及等位基因頻率在病例組與對照組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，探討FCER1B基因rs569108和STAT6基因rs324015位點(diǎn)與小麥過敏的易感相關(guān)性。

對象和方法

分組及入組標(biāo)準(zhǔn)

本研究共設(shè)小麥過敏組、非小麥過敏組和健康對照組3組。

小麥過敏組入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者食入小麥制品后發(fā)生食物過敏，或食入小麥制品4～6 h內(nèi)運(yùn)動發(fā)生WDEIA，或吸入面粉后發(fā)生BA；(2)小麥特異性IgE(specific IgE，sIgE)>0.35 kUA/L，或麥膠蛋白sIgE>0.35 kUA/L，或ω-5-醇溶蛋白sIgE>0.35 kUA/L。同時符合以上2個條件的患者可入組。

非小麥過敏組入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有過敏性疾病，但與小麥不相關(guān)；(2)小麥sIgE<0.35 kUA/L，且麥膠蛋白sIgE<0.35 kUA/L，且ω-5-醇溶蛋白sIgE<0.35 kUA/L。同時符合以上2個條件的過敏患者可入組。

健康對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)無過敏性鼻炎；(2)無過敏性哮喘及咳嗽；(3)無皮膚過敏癥；(4)無食物過敏；(5)小麥sIgE<0.35 kUA/L，且麥膠蛋白sIgE<0.35 kUA/L，且ω-5-醇溶蛋白sIgE<0.35 kUA/L。同時滿足以上5條標(biāo)準(zhǔn)，即可入組。

對象

小麥過敏組：根據(jù)小麥過敏組入組標(biāo)準(zhǔn)的2個條件，對2004年3月至2010年3月就診于北京協(xié)和醫(yī)院的疑似小麥過敏的患者進(jìn)行詳細(xì)的病史和基本信息的采集，最終入組63例確診小麥過敏患者，小麥過敏包括食物過敏、WDEIA及BA。63例小麥過敏組患者，首次發(fā)病的年齡范圍為12～69歲，首次發(fā)病的平均年齡為(36.02±13.79)歲。其中，男31例，女32例，男女比例為0.97∶1。

非小麥過敏組：2004年3月至2010年3月就診于北京協(xié)和醫(yī)院的75例其他因素誘發(fā)過敏性疾病的患者，過敏性疾病包括其他食物誘發(fā)的食物過敏、花粉癥、藥物過敏等。75例非小麥過敏組患者，發(fā)病年齡范圍為5～71歲，平均年齡為(31.93±13.88)歲。其中，男30例，女45例，男女比例為0.67∶1。

健康對照組：2010年3月至2010年8月北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心197例非過敏健康人。年齡為21～77歲，平均年齡為(37.03±11.21)歲。其中，男92例，女105例，男女比例為0.88∶1。

方法

基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)進(jìn)行SNP分型。實(shí)驗(yàn)分為DNA提取及SNP分型兩步驟進(jìn)行。DNA提?。河萌蚪MDNA提取試劑盒提取本實(shí)驗(yàn)所有樣本DNA(人類全血基因組DNA提取試劑盒，大連寶生物工程有限公司)。SNP分型：PCR反應(yīng)(PCR Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司)；酶切(限制性內(nèi)切酶，NEB)；PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物、擴(kuò)增片段長度、限制性內(nèi)切酶以及酶切條件見表1。

sIgE檢測應(yīng)用Phadia 250檢測系統(tǒng)，ImmunoCAP檢測試劑，ThermoFisher Scientific。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件，行χ2檢驗(yàn)分析SNP基因型在各對照組中的Hardy-Weinberg平衡；在遵循Hardy-Weinberg平衡定律的基礎(chǔ)上，利用Fisher’s檢驗(yàn)分析SNP的基因型頻率及等位基因頻率在小麥過敏組、非小麥過敏組與健康對照組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

倫理審核

本研究已得到北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

結(jié)　　果

SNP分型

FCER1B基因rs569108多態(tài)位點(diǎn)的酶切圖譜，純合子CC 103 bp，純合子TT 80 bp，雜合子CT 103、80 bp(圖1)。STAT6基因rs324015多態(tài)位點(diǎn)的酶切圖譜，純合子AA 93 bp，純合子GG 74 bp，雜合子AG 93、74 bp(圖2)。

SNP在各組的基因型和等位基因頻率分布

rs569108和rs324015位點(diǎn)的三種基因型和兩種等位基因在各組的頻率分布見表2。其中，rs569108位點(diǎn)的基因型CC在小麥過敏組中的統(tǒng)計(jì)值為0。

Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

FCER1B基因rs569108和STAT6基因rs324015位點(diǎn)的基因型頻率在各組的分布均符合Hardy-Weinderg遺傳平衡定律(P>0.05)(表3)，說明所選擇的樣本具有群體代表性。

表1　PCR擴(kuò)增及其酶切反應(yīng)條件Table 1　Conditions of PCR and restriction enzyme digestion

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

表2　FCER1B基因rs569108和STAT6基因rs324015位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布Table 2　Genotype frequencies distribution and allele frequencies distribution of loci of rs569108 in FCER1B gene and rs324015 in STAT6 gene

FCER1B 基因rs569108或STAT6基因rs324015與小麥過敏的關(guān)聯(lián)性

差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩個位點(diǎn)的基因型頻率分布和等位基因頻率分布在小麥過敏患者與非小麥過敏患者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)，在小麥過敏患者與健康對照者間比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

FCER1B基因rs569108或STAT6基因rs324015與小麥過敏患者的sIgE水平關(guān)聯(lián)性

對于FCER1B基因rs569108，因小麥過敏組無CC基因型，只比較CT基因型患者的sIgE水平與TT基因型患者sIgE水平間的差異，結(jié)果顯示，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

表3　FCER1B基因rs569108和STAT6基因rs324015位點(diǎn)在各組的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)Table 3　Hardy-Weinberg genetic equilibrium test of rs569108 in FCER1B gene and rs324015 in STAT6 gene in each group

表4　FCER1B基因rs569108和STAT6基因rs324015位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在小麥過敏患者組與非小麥過敏患者組之間的差異統(tǒng)計(jì)Table 4　Difference statistical results of the genotype frequencies and allele frequencies between patients with wheat allergy and patients with non-wheat allergyfor loci of rs569108 FCER1B gene and rs324015 in STAT6 gene

OR：比值比；CI：可信區(qū)間

表5　FCER1B基因rs569108和STAT6基因rs324015位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在小麥過敏患者組與健康對照組之間的差異統(tǒng)計(jì)Table 5　Difference statistical results of the genotype frequencies and allele frequencies between patients with wheat allergy and healthy controls for loci of rs569108 FCER1B gene and rs324015 in STAT6 gene

OR：比值比；CI：可信區(qū)間

圖3FCER1B基因rs569108多態(tài)位點(diǎn)CT基因型小麥過敏患者sIgE與TT基因型小麥過敏患者sIgE的比較

Fig3Comparison of sIgE levels between the group with CT and the group with TT for rs569108 polymorphic locus inFCER1Bgene

對于STAT6基因rs324015，比較次要等位基因純合子AA患者的sIgE水平與含主要等位基因患者(AG+GG)sIgE水平間的差異，以及AG基因型患者sIgE水平與GG基因型患者sIgE水平間的差異，結(jié)果顯示均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(圖4、5)。

討　　論

在以往過敏性疾病遺傳學(xué)研究中，STAT6基因和FCER1B基因的SNPs被證明與多種過敏性疾病相關(guān)。

FCER1B基因位于11q12.1，全長10 kb，7個外顯子，6個內(nèi)含子。研究證明FCER1B基因多態(tài)性與過敏性疾病相關(guān)[6]。位于FCER1B基因啟動子區(qū)域的rs569108位點(diǎn)與免疫受體酪氨酸活化基序位點(diǎn)相近，這個酪氨酸活化基序與γ鏈相互作用，最終影響IgE細(xì)胞信號通路效率[7]。也有研究指出，F(xiàn)CER1B基因的rs569108位點(diǎn)與rs1441585、rs574700位點(diǎn)緊密連鎖，影響過敏性疾病的發(fā)展；其位點(diǎn)的等位基因C是日本兒童過敏性疾病的危險因素[8]。

STAT6是過敏反應(yīng)誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)的重要因子。STAT6定位于12q13.3-q14.1，全長19 kb，有23個外顯子，22個內(nèi)含子。位于3’UTR區(qū)內(nèi)的SNP rs324015可影響mRNA的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)的表達(dá)量[9]。英國高加索人群中，STAT6 基因的rs324015位點(diǎn)與堅(jiān)果過敏的易感性及嚴(yán)重性相關(guān)，且等位基因G、基因型GG是嚴(yán)重過敏反應(yīng)的危險因素[10-11]。日本人群中，STAT6基因的rs324015位點(diǎn)與過敏性哮喘相關(guān)[12]。然而，在高加索人的同胞對研究中則顯示STAT6基因的rs324015位點(diǎn)與哮喘無關(guān)聯(lián)[13]。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)STAT6基因的rs324015位點(diǎn)與STAT6第一外顯子13-GT突變存在連鎖不平衡，聯(lián)合評價這兩個突變位點(diǎn)是預(yù)測過敏疾病的有效方法[14]。

雖然以往多項(xiàng)研究證明FCER1B基因rs569108位點(diǎn)和STAT6基因rs324015位點(diǎn)與過敏性疾病相關(guān)，但本研究中FCER1B基因SNP rs569108位點(diǎn)和STAT6基因SNP rs324015位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在小麥過敏組與非小麥過敏組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在小麥過敏組與健康對照組之間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且FCER1B基因rs569108或STAT6基因rs324015與小麥過敏患者的sIgE水平無關(guān)聯(lián)。由此提示FCER1B基因rs569108位點(diǎn)和STAT6基因rs324015位點(diǎn)與小麥過敏的易感性不相關(guān)。

圖4STAT6基因rs324015多態(tài)位點(diǎn)AA基因型小麥過敏患者sIgE與(AG+GG)基因型小麥過敏患者sIgE的比較

Fig4Comparison of sIgE levels between the group with AA and the group with (AG+GG)for rs324015 polymorphic locus inSTAT6 gene.

圖5STAT6基因rs324015多態(tài)位點(diǎn)，AG基因型小麥過敏患者sIgE與GG基因型小麥過敏患者sIgE的比較

Fig5Comparison of sIgE levels between the group with AG and the group with GG for rs324015 polymorphic locus inSTAT6 gene.

本研究結(jié)果提示，rs569108和rs324015位點(diǎn)可能不參與小麥過敏的發(fā)生，這與以往諸多研究結(jié)果不一致。造成這種不一致的因素可能是：(1)基于小麥過敏的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，本研究樣本量小，未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。(2)病例-對照組中研究對象存在各種因素的分層現(xiàn)象，本研究3個組別的研究對象平均年齡及年齡范圍均不一致，可能存在年齡分層；本研究4個組別的男女比有差異，可能存在性別分層。因此，人群分層在基因多態(tài)性位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)研究中值得關(guān)注。(3)本 研究的研究對象是漢族，與既往相關(guān)研究對象的民族不同，造成遺傳背景不同。(4)研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)不一致，也會影響研究結(jié)果。

小麥過敏是一種多因子復(fù)雜疾病。進(jìn)行基因-基因相互作用、基因-環(huán)境相關(guān)作用與小麥過敏相關(guān)性的研究，可能比研究單個SNP位點(diǎn)與復(fù)雜疾病的關(guān)聯(lián)性更有效。同時，外顯子組測序和全基因組測序也許是揭示復(fù)雜疾病的人類遺傳學(xué)背景的更有效工具[15-16]。

(致謝：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳系劉彥山為本實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)支持)

(本文圖1、2見插頁第Ⅰ頁)

[1]Tatham AS, Shewry PR. Allergens to wheat and related cereals[J]. Clin Exp Allergy, 2008, 38：1712-1726.

[2]Naoko Inomata. Wheat allergy[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2009, 9：238-243.

[3]Gyu-Young Hur, Dong-Hee Koh, Hyoun-Ah Kim, et al. Prevalence of work-related symptoms and serum-specific antibodies to wheat flour in exposed workers in the bakery industry[J]. Res Med, 2008, 102：548-555.

[4]Shewry PR. Wheat[J]. J Exp Bot, 2009, 60：1537-1553.

[5]Lunetta KL. Genetic association studies[J]. Circulation, 2008, 118：96-101.

[6]Shirakawa T, Li A, Dubowitz M, et al. Association between atopy and variants of the beta subunit of the high-affinity immunoglobulin E receptor[J]. Nat Genet, 1994, 7：125-129.

[7]Nishiyama C, Akizawa Y, Nishiyama M, et al. Polymorphisms in theFCER1Bpromoter region affecting transcription activity： a possible promoter-dependent mechanism for association betweenFCER1Band Atopy[J]. J Immunol, 2004, 173：6458-6464.

[8]Thomas NS, Wilkinson J, Holgate ST. The candidate region approach to the genetics of asthma and allergy[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 156：144-151.

[9]Jacob CO, Lee Sk, Strassmann G. Mutational analysis of TNF-alpha gene reveals a regulatory role for the 3’untranslated region in the genetic predisposition to lupus-like autoimmune disease[J]. J Immunol, 1996, 156：3043-3050.

[10] Amoli M, Ollier WE, Hajeer AH. A novel PCR-RFLP assay for the detection of a polymorphism in the 3’ ofSTAT6 gene[J]. Genes Immun, 2000, 1：349-350.

[11] Amoli MM, Hand S, Hajeer AH, et al. Polymorphism in the STAT6 gene encodes risk for nut allergy[J]. Genes Immun, 2002, 3：220-224.

[12] Gao PS, Mao XQ, Roberts MH, et al. Variants ofSTAT6 (signal transducer and activator of transcription 6) in atopic asthma[J]. J Med Genet, 2000, 37：380-382.

[13] Duetsch G IT, and Wjst M.STAT6 as an asthma candidate gene： polymorphism-screening, association and haplotype analysis in a Caucasian sib-pair study[J]. Hum Mol Genet, 2002, 11：613-621.

[14] Tamura K, Suzuki M, Arakawa H, et al. Linkage and association studies ofSTAT6 gene polymorphisms and allergic diseases[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2003, 131：33-38.

[15] Bamshad MJ, Ng SB, Bigham AW, et al. Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery[J]. Nat Rev Genet, 2011, 12：745-755.

[16] Cirulli ET, Goldstein DB. Uncovering the roles of rare variants in common disease through whole-genome sequencing[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11：415-425.