袁 媛，邱 霞

急性毒性試驗(yàn)(acute toxicity test)是大劑量高濃度藥物1次給予試驗(yàn)動(dòng)物，目的是了解外源性化合物短期內(nèi)的毒性作用，并對(duì)診斷、預(yù)防和急救治療提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)就急性毒性試驗(yàn)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 對(duì)半數(shù)致死量(LD50)的重新評(píng)價(jià)

毒理學(xué)家通過長(zhǎng)期實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)同一化合物，用同一品系動(dòng)物，同樣的實(shí)驗(yàn)條件和方法，卻得出不同的LD50值，甚至相差幾倍。LD50實(shí)際上是對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)處理后計(jì)算產(chǎn)生的一個(gè)數(shù)值。毒理學(xué)評(píng)價(jià)應(yīng)具備中毒表現(xiàn)、出現(xiàn)中毒和持續(xù)的時(shí)間，毒性涉及臟器的損傷程度、可逆性質(zhì)、死亡過程及死亡原因等系列毒性資料[1]。實(shí)際上急性毒性試驗(yàn)應(yīng)從定性和定量?jī)蓚€(gè)方面進(jìn)行觀察和研究，否則容易造成錯(cuò)誤的評(píng)價(jià)。LD50只是毒性測(cè)試的第一步，遠(yuǎn)不能回答急性試驗(yàn)的全部?jī)?nèi)容。

2 LD50代替法的興起

早在1876年英國(guó)政府就頒布了“關(guān)于禁止虐待動(dòng)物法”，在《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法則》中明確規(guī)定大學(xué)畢業(yè)經(jīng)考核合格，持有許可證方可參與或在監(jiān)督下進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。1959年，在動(dòng)物學(xué)家William Russell和微生物學(xué)家Rex Burch發(fā)表的《人道的動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)原則》中提出了應(yīng)用動(dòng)物研究的3Rs原則，即替代(replace)、減少(reduce)和優(yōu)化(refine)，即在生命科學(xué)研究中應(yīng)采取其他手段來代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法、減少動(dòng)物數(shù)量和痛苦，但沒有引起世人的重視[2]。 直至20世紀(jì)80年代，許多國(guó)家成立了代替法組織，并組織了代替法國(guó)際會(huì)議，北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)也成立了該組織，并參加了國(guó)際會(huì)議。在世界性保護(hù)動(dòng)物組織的壓力下，目前各國(guó)都在研究LD50代替法，并取得了一定進(jìn)展，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)無法完全被其他技術(shù)所代替，因此盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用量，將是今后探討的方向。

3 幾種新的急性毒性評(píng)價(jià)方法

3.1 固定劑量法(fixed dose procedure，F(xiàn)DP) 本法設(shè)固定劑量、觀察動(dòng)物反應(yīng)，不以死亡為依據(jù)，而且按毒性癥狀來判斷該物質(zhì)的危險(xiǎn)程度。這樣一個(gè)試驗(yàn)只需10～20只動(dòng)物。設(shè)5、50、300、2000 mg/kg 4個(gè)劑量組，(必要時(shí)可以增加至5000 mg/kg)，依次使用同一性別的動(dòng)物(一般為雌性)，經(jīng)口染毒。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定會(huì)發(fā)生毒性反應(yīng)但不產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)或死亡的劑量作為起始劑量進(jìn)行試驗(yàn)，再根據(jù)觀察的結(jié)果調(diào)整毒性劑量，當(dāng)出現(xiàn)以下情況時(shí)終止試驗(yàn)：(1)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)或已確認(rèn)不多于1只動(dòng)物死亡；(2)最高劑量未出現(xiàn)毒性反應(yīng)；(3)最低劑量動(dòng)物出現(xiàn)死亡。

此法早在1984年由英國(guó)毒理學(xué)會(huì)提出，經(jīng)布魯塞爾協(xié)議后歐洲委員會(huì)出資50萬英鎊，由美國(guó)、日本、歐洲等33個(gè)研究室共同進(jìn)行20個(gè)化合物的新舊方法急性毒性試驗(yàn)對(duì)比，其毒性分級(jí)一致率為87.2%。結(jié)果證實(shí)可以代替從1927年以來沿用的LD50法，而且為危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)提供了對(duì)急性毒性所需的足夠資料，包括中毒作用性質(zhì)、中毒發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和結(jié)局等。布魯塞爾委員會(huì)也承認(rèn)了固定劑量法的實(shí)用價(jià)值。

3.2 急性毒性分類法(acute toxic class method，ATC) 急性毒性分類法是由Sumiey于1990年提出的一種評(píng)估化合物急性毒性的簡(jiǎn)單方法[3]，每性別每一劑量?jī)H用3只動(dòng)物，首先用2000 mg/kg劑量，如無死亡即可結(jié)束試驗(yàn)，因?yàn)長(zhǎng)D50一般為最大無致死劑量(MNLD)的2～2.5倍。這意味著化合物在2000 mg/kg劑量時(shí)無動(dòng)物死亡，其LD50大約為400～5000 mg/kg，因此就沒有必要進(jìn)一步做致死劑量的試驗(yàn)。如有死亡則應(yīng)用200 mg/kg繼續(xù)試驗(yàn)。用本法估算的LD50與傳統(tǒng)的LD50試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3.3 上下法(up-and-down procedure，UDP) 上下法作為經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(organization for economic cooperation and development，OECD)于2001年新修訂發(fā)布的急性毒性試驗(yàn)方法之一，是傳統(tǒng)急性毒性試驗(yàn)的一個(gè)替代方法，有著巨大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

上下法由限度試驗(yàn)和主試驗(yàn)組成。限度試驗(yàn)又分為2000 mg/kg和5000 mg/kg劑量水平，用于受試物毒性可能較小的情況。2種劑量的限度試驗(yàn)具體步驟有細(xì)微差別，但最多僅用5只動(dòng)物。設(shè)計(jì)限度劑量5000 mg/kg，將受試物按5000 mg/kg給予1只動(dòng)物。觀察48 h，如果該動(dòng)物死亡，則進(jìn)行主試驗(yàn)；如果該動(dòng)物存活，依次將受試物給予另外2～4只動(dòng)物。有3只或3只以上動(dòng)物存活時(shí)，LD50大于5000 mg/kg；有3只或3只以上動(dòng)物死亡時(shí)，LD50小于5000 mg/kg[4]。主試驗(yàn)是一個(gè)預(yù)先設(shè)計(jì)的給藥程序，在此程序中，每次給藥1只動(dòng)物，若該動(dòng)物存活，第2只動(dòng)物給予高一級(jí)劑量，若第1只動(dòng)物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，第2只動(dòng)物給予低一級(jí)劑量。在對(duì)每只給藥動(dòng)物仔細(xì)觀察48 h后，可以決定是否對(duì)下1只動(dòng)物給藥，以及給藥劑量。當(dāng)最高劑量下有連續(xù)3只動(dòng)物存活，或在6只動(dòng)物中有5只連續(xù)發(fā)生在高一級(jí)劑量死亡、在低一級(jí)劑量生存的生死轉(zhuǎn)換等情況時(shí)，可以停止試驗(yàn)。根據(jù)終止時(shí)所有動(dòng)物的狀態(tài)，用最大可能性法計(jì)算LD50值[5]。

在應(yīng)用上下法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)中，起始劑量的設(shè)計(jì)十分重要。在指導(dǎo)原則中，要求起始劑量的設(shè)計(jì)比最接近LD50估計(jì)值的劑量低一級(jí)。這樣不但能夠減少上下法中使用的動(dòng)物數(shù)量，也可以使得到的試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。除了起始劑量外，組距的確定也對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有較大影響，不同劑量級(jí)數(shù)因子的選擇可以改變LD50及95%置信區(qū)間[6]?？梢允褂米畲笙嗨品ㄓ?jì)算LD50值以及95%置信區(qū)間。在整個(gè)主試驗(yàn)過程中，劑量級(jí)數(shù)因子應(yīng)選定為1/(劑量-反應(yīng)曲線斜率估計(jì)值)的反對(duì)數(shù)。默認(rèn)假設(shè)通常為1.3(Sigma=0.12)的劑量級(jí)數(shù)因子適于很廣泛的化合物，可以作為大多數(shù)化合物的大致估計(jì)值，用它進(jìn)行試驗(yàn)得到的LD50與Sigma在0.05～0.25之間的化合物的LD50均無明顯差異，對(duì)毒性分級(jí)就更加沒有影響了[7]。

與傳統(tǒng)的急性毒性試驗(yàn)方法相比，上下法具有很多明顯的優(yōu)點(diǎn)，主要表現(xiàn)在以下幾方面：(1)符合維護(hù)動(dòng)物福利的要求[8-9]。(2)能夠得到LD50的估計(jì)值及相應(yīng)的置信區(qū)間[10]。(3)能夠觀察毒性表現(xiàn)。(4)所需的受試物量少[11]。(5)應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)用性強(qiáng)。

盡管上下法與傳統(tǒng)方法相比有了很多改進(jìn)，但仍存在一些不足。例如：由于試驗(yàn)要求分階段進(jìn)行，因此比較耗時(shí)[12]；只適用于評(píng)價(jià)那些染毒后動(dòng)物在48 h內(nèi)出現(xiàn)毒性癥狀并死亡的化學(xué)物質(zhì)的急性毒性，若某受試物估計(jì)其染毒的動(dòng)物發(fā)生延遲死亡，則不適用；無法像傳統(tǒng)方法那樣提供劑量-效應(yīng)曲線的數(shù)據(jù)；雖然有效減少了試驗(yàn)動(dòng)物的死亡數(shù)量，但仍然以死亡作為觀察的終點(diǎn)，終究要付出動(dòng)物生命的代價(jià)。但有專家預(yù)測(cè)，由于上下法與不以死亡為觀察終點(diǎn)的固定劑量法相比，出現(xiàn)毒性反應(yīng)的概率接近，因此具有發(fā)展為不以死亡為終點(diǎn)的方法的潛力。

目前對(duì)農(nóng)藥的安全性評(píng)價(jià)的主要手段還是動(dòng)物毒性試驗(yàn)，1995年在東京召開的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)規(guī)范(GLP)協(xié)調(diào)會(huì)議就提出動(dòng)物毒性試驗(yàn)不測(cè)LD50也可以，主要盡可能用少量動(dòng)物獲得更多的急性毒性信息。急性毒性代替方法的建立與應(yīng)用，能夠大量減少試驗(yàn)中所用的動(dòng)物數(shù)量，減少樣品消耗，節(jié)約試驗(yàn)資源，降低開發(fā)成本，保護(hù)動(dòng)物權(quán)益[13]。在我國(guó)改進(jìn)經(jīng)典的LD50測(cè)定法也是勢(shì)在必行。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王捷，梁震，劉瑛.急性毒性LD50實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)展[J].農(nóng)藥，2000，39(5)：45-46.

[2] Fleeknell P．Replacement，reduction and refinement[J]．ALTEX，2002，19(2)：73-78.

[3] Sumiey.一種評(píng)估化合物急性毒性的簡(jiǎn)單方法[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，1991，(5)：294.

[4] 連勇，徐培渝，孫強(qiáng).上下法替代實(shí)驗(yàn)與Horn′s法測(cè)定LD50的試驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35(18)：3591-3593.

[5] 李佳，金晶，黃芝瑛.上下法在急性毒性試驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(6)：70-72.

[6] 張林媛，孫金秀.上下增減劑量法與Horn′s法測(cè)定LD50的研究[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2003，17(4)：234-236.

[7] Lipnick RRL, Cotrnvo JA, Hill RN, et al. Comparison of conventional LD50, toxicity the up-and-down, and fixed-dose acute procedures[J]. Fd Chem Toxic, 1995,33(3): 223-231.

[8] Fleeknell P. Replacement, reduction and refinement[J]. ALTEX, 2002,19(2):73-78..

[9] 王捷，張麗姝．對(duì)LD50的重新評(píng)價(jià)[J]．衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2003,14(3)：188-189.

[10] Rispin A，F(xiàn)arrar D，Margosches E，et al．Alternative methods for the median lethal dose[LD(50)]test：the up-and-down procedure for acute oral toxicity[J]．ILAR J，2002，43(4)：233-243．

[11] 秦愛平，袁素波，王全軍，等．Z24系列化合物一般毒性的比較研究[J]．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2007，31(1)：50-53．

[12] Walum E．Acute oral toxicity[J]．Environ Health Persia，1998，106(2)：497-503．

[13] 譚劍斌，趙敏.體內(nèi)外代替方法在急性毒性評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展[J].毒理學(xué)雜志，2010，24(6)：479-482．