李 森 劉克建 趙詠梅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京100053)

鋅元素是人體內(nèi)含量豐富的必需微量元素之一，在皮膚、骨、肝臟、肌肉和腦中廣泛存在。除參與組成細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的各種酶之外，鋅對(duì)于保證這些蛋白的生物活性也是至關(guān)重要的。在神經(jīng)系統(tǒng)，機(jī)體通過(guò)復(fù)雜而精確的調(diào)節(jié)機(jī)制使鋅離子保持在正常濃度范圍內(nèi)發(fā)揮作用。過(guò)量的鋅則有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［1］。

1 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鋅穩(wěn)態(tài)

有證據(jù)［2-3］表明，鋅具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。在突觸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，鋅離子被釋放到突觸間隙，然后可以通過(guò)鄰近細(xì)胞的門(mén)控通道進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。這些釋放鋅離子的神經(jīng)元同時(shí)可釋放谷氨酸，因此被稱為“谷氨酸鋅能神經(jīng)元(gluzinergic neurons)”。鋅離子經(jīng)其轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zn2+transporters，ZnTs)進(jìn)入谷氨酸鋅能神經(jīng)元突起末端的突觸囊泡，并和谷氨酸一起儲(chǔ)存。正常刺激時(shí)，鋅離子和谷氨酸一同釋放入突觸間隙，并作用于突觸后通道蛋白如GABA受體、NMDA受體或電壓門(mén)控通道等［3］。在諸多ZnT蛋白中，ZnT1和ZnT3在腦內(nèi)的分布與富含鋅的突觸囊泡分布極為相近。用 ZnT3敲除小鼠的研究［1，4］證明，ZnT3 在鋅離子向突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中是必須的。而ZnT1有助于鋅離子向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，在一定程度上可以阻止鋅離子的毒性作用。

鋅的攝取和釋放由胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)，而鋅的緩沖調(diào)節(jié)與一種叫做金屬硫蛋白(metallothionein，MT)的蛋白家族有關(guān)［5］。有證據(jù)［5-6］證明，細(xì)胞內(nèi)的鋅離子聚集也來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)，如線粒體等。MT是一種低相對(duì)分子質(zhì)量的富含半胱氨酸和金屬成分、缺少芳香族氨基酸的蛋白。半胱氨酸具有兩個(gè)分別與鋅相連的結(jié)構(gòu)域，使得蛋白成啞鈴狀。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，MT1和MT2大多在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而在神經(jīng)元中非常少見(jiàn)。相反，MT3多在神經(jīng)元中表達(dá)，由于其在腦內(nèi)的廣泛分布，MT3在神經(jīng)元的鋅穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。

2 缺血時(shí)鋅離子水平的改變

2.1 缺血時(shí)突觸末端釋放的鋅離子從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞

缺血時(shí)，大量的鋅離子從突觸末端釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)移并聚集于突觸后神經(jīng)元內(nèi)。研究［7］表明，在缺血開(kāi)始后7 min即可觀察到缺血區(qū)鋅陽(yáng)性細(xì)胞末端的染色變淡，直到缺血后第7天。鋅染色的這種迅速減少直至最終消失與鋅離子從突觸小泡釋放有關(guān)。Kitamura等［8］采用微量透析技術(shù)研究了細(xì)胞外鋅離子水平的變化，觀察到缺血期大鼠腦組織海馬CA1區(qū)內(nèi)鋅離子的聚集。缺血后15 min，胞外鋅離子水平達(dá)到了一個(gè)峰值(600 nmol/L)，是基礎(chǔ)水平的2倍。隨后，胞外鋅離子水平下降并于再灌注后15 min回到基礎(chǔ)水平，而海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞在缺血24 h后出現(xiàn)胞內(nèi)鋅離子聚積。鋅離子聚集的機(jī)制可能與文獻(xiàn)報(bào)道［1-2］的谷氨酸鹽聚集的機(jī)制相似，包括進(jìn)行性突觸前ATP水平的缺失、去極化以及突觸小泡融合等。近來(lái)一項(xiàng)研究［9］提示，在動(dòng)物模型或患者中，缺血后數(shù)小時(shí)乃至數(shù)天內(nèi)重復(fù)擴(kuò)散性的去極化很可能是鋅離子聚集的重要原因。缺血腦片模型中突觸鋅離子釋放的波形變化與去極化的傳播相一致，使鋅離子大量釋放進(jìn)入已受損的腦內(nèi)［10］。

2.2 缺血時(shí)鋅離子從胞內(nèi)存儲(chǔ)中釋放

盡管有關(guān)腦缺血的體內(nèi)研究多集中在突觸囊泡中的鋅元素，但近來(lái)很多的全腦缺血模型或者其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)，缺血期胞內(nèi)鋅離子的聚積是突觸釋放和胞內(nèi)存儲(chǔ)釋放協(xié)同作用的結(jié)果［6，11］。

Frederickson等［12］檢測(cè)了缺血及再灌期細(xì)胞外鋅離子水平的變化。缺血開(kāi)始后，胞外鋅離子水平與谷氨酸同步上升。然而，再灌注引起的鋅離子釋放無(wú)論在密度上還是時(shí)程上都比缺血更為強(qiáng)烈。由于再灌注引起的鋅離子釋放并不與谷氨酸釋放相伴隨，提示再灌注引起的鋅離子釋放來(lái)源于MT或線粒體等胞質(zhì)內(nèi)貯存鋅的結(jié)構(gòu)。

MT蛋白是含量豐富的鋅緩沖蛋白，能結(jié)合大量的鋅離子。缺血時(shí)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和酸中毒可以誘導(dǎo)鋅離子從MT釋放，使胞內(nèi)鋅離子大量增加。這一過(guò)程已在培養(yǎng)的神經(jīng)元中得到證實(shí)［13］，可以解釋為什么在ZnT3敲除動(dòng)物的海馬錐體神經(jīng)元中仍有鋅離子的聚集，以及為什么敲除MT3可以減少癇性發(fā)作誘導(dǎo)的突觸后鋅離子上升［14］。

鋅離子與MT的相互關(guān)系對(duì)神經(jīng)元活性有多方面的影響。除在特定情況下釋放鋅離子造成毒性損傷外，MT3還能通過(guò)結(jié)合跨膜而來(lái)的多余鋅離子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［15］。在局部缺血模型中，MT3敲除小鼠的損傷更為嚴(yán)重，可能由于這些小鼠不能將缺血過(guò)程中胞內(nèi)其他鋅儲(chǔ)存位點(diǎn)釋放的鋅離子聚集并隔離起來(lái)，因而加重了損傷程度［16］。體外研究［17］證實(shí)，鋅離子可以誘導(dǎo)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)依賴的MT磷酸化，導(dǎo)致缺血時(shí)鋅離子急劇上升。因此，目前還很難確定在不同的缺血模型中MT是有利還是有害。

像鈣離子一樣，鋅離子也能聚集存在于線粒體基質(zhì)中，這是鋅離子毒性作用的重要基礎(chǔ)。來(lái)源于線粒體的鋅離子流可能通過(guò)去極化以及線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn) 孔 (mitochondrialpermeability transition pore，mPTP)的開(kāi)放直接導(dǎo)致胞質(zhì)鋅離子水平的上升［18］。除了MT蛋白及線粒體之外，鋅離子也可能從胞內(nèi)其他結(jié)合位點(diǎn)釋放。明確MT蛋白、線粒體以及可能存在的其他胞內(nèi)鋅儲(chǔ)存點(diǎn)之間的關(guān)系可以為控制缺血后鋅離子水平的病理性上升提供理論依據(jù)。

3 缺血后鋅離子對(duì)細(xì)胞代謝的影響

3.1 鋅離子對(duì)線粒體功能有重要影響

病理性的鋅聚集可以以多種方式影響線粒體功能。急劇的鋅超載可引起嚴(yán)重的線粒體功能障礙及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，繼而引起細(xì)胞壞死，而輕度的胞內(nèi)鋅超載則可能放大凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13，19］。鋅離子能導(dǎo)致培養(yǎng)的神經(jīng)元線粒體腫脹及ROS釋放［20］。盡管鈣離子也能誘導(dǎo)線粒體出現(xiàn)相似的改變，但鋅離子的作用更強(qiáng)烈。然而，目前有關(guān)鋅離子誘導(dǎo)mPTP開(kāi)放的研究結(jié)果并不一致，提示可能存在器官(肝、腦)差異性或者其他參與因素。

鋅離子對(duì)線粒體的影響是復(fù)雜多樣的。鋅離子可抑制線粒體中電子的轉(zhuǎn)運(yùn)，并不可逆地阻斷關(guān)鍵的線粒體酶，這一作用似與mPTP的激活有關(guān)［18］。而抑制線粒體ATP產(chǎn)生、刺激ROS產(chǎn)生及釋放或者激活mPTP后釋放促凋亡因子如細(xì)胞色素C或凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等都可以誘導(dǎo)缺血損傷。一些在缺血模型中的研究［21］表明，內(nèi)源性鋅離子參與了線粒體功能障礙。在缺血起始階段，螯合鋅離子可以減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放及caspase3-激活。此外，在氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)的海馬腦片中，內(nèi)源性鋅離子在OGD起始后短時(shí)間內(nèi)聚集于線粒體，并導(dǎo)致線粒體膜電位的不可逆性缺失［22］。

3.2 作用于胞質(zhì)中某些靶點(diǎn)抑制細(xì)胞代謝

除了對(duì)線粒體的直接作用外，鋅離子對(duì)細(xì)胞的其他代謝功能也有影響。在培養(yǎng)的神經(jīng)元中，鋅離子能夠激活PKC，誘導(dǎo)NADPH氧化酶的激活，并能誘導(dǎo)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活化以及超氧化物、氮化物和過(guò)氧硝酸鹽產(chǎn)生［23］。鋅離子也能調(diào)節(jié)缺血時(shí)AMPA通道和/或紅藻氨酸(kainic acid)通道(Ca-A/K通道)GluR2亞基的表達(dá)，使得Ca-A/K通道對(duì)鈣離子的通透性增加［24］。

自由基誘導(dǎo)的DNA鏈斷裂導(dǎo)致DNA修復(fù)酶-多聚核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］的激活。PARP催化ADP核糖單位從NAD+到多種核蛋白產(chǎn)物，導(dǎo)致NAD+缺失、糖代謝受阻及繼發(fā)性ATP 缺失［25］。文獻(xiàn)［26］報(bào)道，暴露于 400 μmol/L 的鋅離子可導(dǎo)致培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元PARP活化及NAD+缺失，且NADPH氧化酶、NOS或者PARP的阻斷劑都能減輕鋅離子對(duì)神經(jīng)元的損傷。PARP的激活導(dǎo)致AIF從線粒體釋放，AIF隨后轉(zhuǎn)移入核內(nèi)并激發(fā)了非caspase依賴的DNA斷裂和細(xì)胞死亡［27］。其他一些研究［28］則報(bào)道了PAR(PARP的多聚體產(chǎn)物)可以直接誘導(dǎo)AIF從線粒體釋放。體內(nèi)研究［29］表明，給予糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸可以消除前腦缺血后的代謝障礙并拮抗鋅離子的神經(jīng)毒性，起到神經(jīng)保護(hù)作用，這可能與它可以繞過(guò)糖代謝受阻并能通過(guò)乳酸脫氫酶促進(jìn) NAD+再生有關(guān)［30-31］。Sirtuins是一類 NAD+代謝酶，其激活劑可以加劇NAD+缺失及鋅離子的神經(jīng)毒性，而其阻斷劑則具有神經(jīng)保護(hù)作用［32］。

除影響神經(jīng)元的代謝外，鋅離子對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的ATP產(chǎn)生同樣具有重要作用。鋅離子造成的ATP減少反過(guò)來(lái)引起星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸鹽攝取障礙，這一作用可以顯著增強(qiáng)缺血損傷中的興奮性毒性。與神經(jīng)元相似，星形膠質(zhì)細(xì)胞的ATP缺失也由PARP活化引起［33］。鋅離子在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活中也有一定作用，參與了缺血晚期的損傷，且鋅離子在小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用同樣與PARP激活有關(guān)［34］。

3.3 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和轉(zhuǎn)錄因子在鋅離子依賴的神經(jīng)損傷中的調(diào)控作用

鋅離子對(duì)多種細(xì)胞信號(hào)通路有重要作用，依賴于外周環(huán)境的不同，這些作用最終可以是保護(hù)作用，也可以是損傷作用。MAPKs在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增生及死亡中有重要作用，并能被多種應(yīng)激條件包括缺血等強(qiáng)烈激活。一些研究［35］表明，鋅離子可以通過(guò)激活膜上 MAPKs家族尤其是 P38和 ERK(extracellular signal-regulated kinase)介導(dǎo)神經(jīng)元損傷。

在培養(yǎng)的神經(jīng)元中，胞內(nèi)鋅離子的聚集(很可能由MT蛋白或其他對(duì)氧化還原敏感的結(jié)合位點(diǎn)釋放)可以導(dǎo)致p38 MAPK通路激活，使得膜上Kv2.1鉀離子通道磷酸化并開(kāi)放，鉀離子電流增加、caspase裂解及細(xì)胞死亡［36］。盡管ERK1/2激活與細(xì)胞存活和分化有關(guān)，但其長(zhǎng)期激活可促進(jìn)細(xì)胞死亡［37］。研究［38］發(fā)現(xiàn)ERK1/2的激活參與鋅離子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。鋅離子可能通過(guò)抑制磷酸酶的活性造成ERK的激活，導(dǎo)致線粒體功能障礙、轉(zhuǎn)錄因子如Egr-1或Elk-1激活，最終導(dǎo)致caspase非依賴的細(xì)胞死亡。而另一項(xiàng)研究［17］表明，鋅離子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子改變可能是預(yù)適應(yīng)的機(jī)制之一，因此，缺血時(shí)鋅離子的作用非常復(fù)雜。

4 鋅離子在腦缺血損傷中作用的時(shí)相性

近期研究［39］表明，在大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，腦梗死半暗帶區(qū)域內(nèi)鋅離子陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目在再灌注24 h內(nèi)隨再灌注時(shí)間增加明顯增多，且MCAO大鼠腦內(nèi)鋅離子陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與腦梗死體積比率呈正相關(guān)。鋅離子對(duì)神經(jīng)元的損傷似乎具有時(shí)相性。早期的鋅超載對(duì)于決定細(xì)胞的存亡是很關(guān)鍵的。在有大量鋅超載時(shí)，鋅離子很有可能造成嚴(yán)重的線粒體功能障礙，鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)以及ROS釋放，導(dǎo)致急性的細(xì)胞壞死［40］。如果神經(jīng)元在急性缺血期幸存，后續(xù)的變化機(jī)制會(huì)更加復(fù)雜。由線粒體損傷或者NADPH氧化酶激活所致的氧化應(yīng)激狀態(tài)能夠損傷核DNA，之后激活PARP。PARP的激活又導(dǎo)致了PAR的聚集以及NAD+的缺失，從而抑制代謝及線粒體功能［26］。隨之而來(lái)的凋亡誘導(dǎo)因子AIF及細(xì)胞色素C的釋放則引發(fā)了核DNA斷裂及凋亡，造成輕度延遲性的神經(jīng)元損傷(約數(shù)小時(shí)后)［27］。如果此時(shí)神經(jīng)元依然存活，P38和(或)ERK1/2 MAPKs的激活可以導(dǎo)致相對(duì)慢性的凋亡及非凋亡性損傷(數(shù)小時(shí)至數(shù)天)［38］，或者鋅離子依賴的轉(zhuǎn)錄抑制子REST的激活可以下調(diào)GluR2表達(dá)，導(dǎo)致鈣/鋅通透性AMPA通道數(shù)量升高及遲發(fā)性的神經(jīng)退行性變(數(shù)天)［11，41］。最后，輕度的鋅離子上升本身并不能造成損傷，但卻誘導(dǎo)了重復(fù)的去極化播散。這使得神經(jīng)元代謝負(fù)荷加重，并可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。重復(fù)播散的去極化可能在卒中發(fā)生后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)進(jìn)一步加速鋅離子釋放及聚集。相反，輕度的鋅超載可以激活預(yù)適應(yīng)通路，進(jìn)而降低腦組織對(duì)缺血的易損性［17，42］。由于缺血不同時(shí)間所致?lián)p傷的機(jī)制不同，因此研究者需要針對(duì)不同的靶點(diǎn)進(jìn)行有效的干預(yù)治療。

綜上所述，鋅離子在機(jī)體正常生理活動(dòng)以及缺血狀態(tài)下均有重要的作用，鋅離子參與了腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞損傷，但目前所發(fā)現(xiàn)的機(jī)制仍不完善，需要研究者繼續(xù)深入探索。鋅離子在缺血后神經(jīng)損傷中的作用可能存在濃度差別并具有時(shí)相性，界定這個(gè)范圍能為下一步的研究提供新策略，并為缺血性腦卒中的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

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