吳藝飛 ，丁茁荑 ，肖杰 ，周曉波 ，李兵

（1.湖南省蔬菜研究所，長沙，410125；2.湖南省蔬菜工程技術研究中心；3.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院；4.恒基兆佳（湖南）房地產(chǎn)發(fā)展有限公司）

紅菜薹（Brassica compestrisssp.chinensisvar.pupureaHort.）為十字花科蕓薹種白菜亞種的變種，是原產(chǎn)于我國長江流域的一種地方特色蔬菜。依靠常規(guī)雜交育種選育一個穩(wěn)定、純合的材料需要3～5 a，耗工、耗時，而通過小孢子培養(yǎng)獲得單倍體后進行人工加倍，只需一個世代就可獲得純合的二倍體，作為雜交育種的親本材料，從而大大加速育種進程。因此，小孢子培養(yǎng)在紅菜薹遺傳和育種中越來越受到重視。

1 研究概況

游離小孢子培養(yǎng)技術的研究始于20世紀70年代初。為了排除花藥壁和絨氈層組織的干擾，直接了解小孢子胚胎發(fā)生的機理，1973年法國學者Nitsch和Norreel設計了一種從花藥中直接分離小孢子的方法，將分離出來的小孢子置于液體培養(yǎng)基中進行薄層培養(yǎng)。這一方法最早用在曼陀羅、矮牽牛和煙草等茄科模式植物上，20世紀80年代以后在一些禾本科農(nóng)作物、蕓薹屬植物上開始研究。1982年德國學者Lichter[1]率先在油菜上進行小孢子培養(yǎng)并獲得胚狀體，他發(fā)現(xiàn)小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體和再生植株要大大多于花藥培養(yǎng)，從而引起眾多育種工作者的關注。此后，游離小孢子培養(yǎng)在很多其他作物上相繼獲得成功，成為很多植物品種改良的重要手段[2～4]。

2004年王濤濤等[5]對紅菜薹進行小孢子培養(yǎng)并率先獲得成功。目前在紅菜薹小孢子培養(yǎng)方面不斷取得新的進展，研究表明，供體植株的基因型、小孢子發(fā)育階段、親本植株的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基組成成分及添加物、小孢子培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件等因素對小孢子的產(chǎn)胚率影響相當大，但再生植株群體的倍性復雜，給育種工作帶來很大的難度[6]。

2 影響小孢子胚產(chǎn)率的因素

2.1 供體植株的基因型差異

關于供體植株的基因型與小孢子胚產(chǎn)率的關系研究很多，盡管所用的材料種類、培養(yǎng)方法等不盡相同，但幾乎所有的研究結(jié)果都表明，不同基因型之間胚胎的發(fā)生頻率差異非常大，同一作物不同品種采用相同的培養(yǎng)條件，出胚多的基因型的出胚率是出胚少的基因型的幾十甚至數(shù)百倍[7，8]。

王濤濤等[5]對5個紅菜薹品種進行小孢子培養(yǎng)中，只有3個產(chǎn)生了胚狀體。張秀武等[9]通過試驗將供試材料分為3類：易成胚材料、較易成胚材料和難成胚材料，并認為產(chǎn)胚量高的親本，其后代攜帶親本中較易產(chǎn)胚的基因，因此也有較高的胚產(chǎn)出率。由此可見，小孢子胚產(chǎn)率同很多其他遺傳性狀一樣，也是受基因調(diào)控的性狀。

2.2 生長條件、取材時期和小孢子發(fā)育階段

大多數(shù)小孢子培養(yǎng)試驗證明，供體植株所處的生長條件，如溫度、日照時數(shù)、株齡以及植株所處的環(huán)境等對胚產(chǎn)率影響非常大，研究人員提出，在小孢子培養(yǎng)試驗中，應盡量使供試植株生長在溫度為15～20℃ 和14～16 h的長日照條件下，以便得到更好的培養(yǎng)效果。在無人工氣候室的情況下，宜把供體植株花期安排在冬季或早春，以避開秋季高溫、短日照等不利環(huán)境對小孢子培養(yǎng)的影響。鄧耀華等[10]認為，紅菜薹小孢子培養(yǎng)受氣溫影響很大，當氣溫達到10℃以上即可進行小孢子培養(yǎng)，紅菜薹小孢子培養(yǎng)的最適溫度為15℃。

除溫度、光照等因素外，植株的株齡對小孢子胚胎發(fā)生率也有一定影響。一般宜選取盛花前期或盛花期無病害植株上健康飽滿的花蕾進行培養(yǎng)。適宜進行小孢子培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時期為單核靠邊期和雙核早期（花蕾長 2～3 mm，花瓣/花藥=1/3～4/5）。

2.3 預處理和預培養(yǎng)方法

①低溫預處理 即接種前將花蕾放在4℃下進行低溫處理。鄧曉輝等[11]的研究結(jié)果表明，接種前將供試花蕾放在4℃條件下進行低溫處理，對小孢子胚產(chǎn)率影響不大，但當處理時間超過5 d后，胚誘導率下降明顯，他認為雖然低溫能減緩小孢子發(fā)育速度，但是對小孢子胚狀體發(fā)生的數(shù)量無影響，因此接種前的低溫處理對小孢子胚誘導率的影響效果不明顯。而張秀武等[9]的試驗結(jié)果表明，低溫處理2 h的花蕾胚誘導率高于未經(jīng)低溫處理的花蕾，但隨著處理時間的延長，胚發(fā)生率反而大幅下降，處理4 d以后基本沒有胚狀體產(chǎn)生。

②高溫誘導 即將接種后的小孢子置于33～35℃高溫下進行胚狀體誘導。鄧曉輝等[11]的研究認為，高溫誘導改變了小孢子的發(fā)育方向，使其由花粉發(fā)育轉(zhuǎn)向胚狀體發(fā)育，因此是誘導小孢子出胚的關鍵因素，但處理時間以12～36 h為宜，超過60h后，小孢子的生理代謝受到嚴重破壞，小孢子活力大大下降，從而導致胚狀體誘導率下降。韓笑等[12]的研究也認為，高溫熱激處理是促進細胞分裂和改變小孢子發(fā)育方面的主要條件，將花椰菜小孢子接種后放在32.5℃高溫下預處理24 h，產(chǎn)胚量明顯提高。

③小孢子濃度 小孢子培養(yǎng)時，小孢子濃度對培養(yǎng)效率有很大的影響，在一定范圍內(nèi)濃度越高，胚狀體誘導率越高，濃度越低，誘導率越低，這種現(xiàn)象稱之為密度效應。不同植物的小孢子培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)濃度不同。肖輝等[13]認為，紅菜薹小孢子培養(yǎng)時，最佳的小孢子濃度為5～6個花蕾/皿，用血球計數(shù)板測量密度為1×105～2×105個/mL。

2.4 培養(yǎng)基添加劑

①活性炭 大多數(shù)的研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭能提高小孢子胚的產(chǎn)率，且能增加子葉形胚的產(chǎn)量，降低畸形胚的數(shù)量。一般活性炭的添加量為0.1%～1.0%，不同品種間有一定差異。活性炭通過吸附培養(yǎng)基中小孢子生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的酚類、酮類等有害物質(zhì)，給小孢子創(chuàng)造更好的發(fā)育環(huán)境，從而提高胚狀體誘導率，但因活性炭是無選擇性的吸附，它在吸附有害物質(zhì)的同時也吸附小孢子，因此當培養(yǎng)基中活性炭過多時，它也會吸附在小孢子的周圍，使小孢子發(fā)育受阻，抑制胚狀體的發(fā)生，使胚誘導率不再增加，甚至出現(xiàn)下降趨勢[14]。

②外源激素 一般添加的外源激素為6-BA和NAA，6-BA的誘導效果比NAA顯著。張秀武等[9]的研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的升高，胚誘導率呈上升趨勢，而畸形胚發(fā)生率也隨之升高，這說明6-BA濃度對胚的形態(tài)及最終形成再生植株的比率影響很大，肖輝等[13]的試驗也證明了這一點。6-BA的作用機理可能為：在游離小孢子體內(nèi)產(chǎn)生與6-BA相結(jié)合的高度專一性和親和力的受體蛋白，有些受體蛋白存在于質(zhì)膜上，與激素相結(jié)合后改變質(zhì)子泵活力和膜的透性；有些受體蛋白存在于細胞質(zhì)和細胞核中，與激素結(jié)合后影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，并對一些特殊酶的合成起調(diào)控作用，從而誘導小孢子產(chǎn)生胚狀體。

3 胚狀體發(fā)生及植株再生的研究

3.1 胚狀體的發(fā)生

一般來說，小孢子培養(yǎng)3～5 d開始進行第1次細胞分裂，7～10 d可形成肉眼可見的球形胚，15～20 d可出現(xiàn)心形、魚雷形及子葉形胚。同蕓薹屬多數(shù)蔬菜一樣，紅菜薹小孢子胚發(fā)育也存在不同步性，同一皿內(nèi)可見到各個不同發(fā)育時期的胚，而發(fā)育早期的球形、心形胚較難以誘導成苗，主要是誘導發(fā)育較好的魚雷形或子葉形胚發(fā)育成完整植株。

3.2 植株再生成苗

鄧曉輝等[11]認為，將發(fā)育較好的魚雷形或子葉形胚轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中，置于4℃下處理10 d后，其出苗率會大大提高。此外，他還通過試驗證明，將子葉形胚接種到含瓊脂1.0%以上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周后，再轉(zhuǎn)至含瓊脂0.7%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以大大提高胚狀體的再生成苗率，這可能是因為小孢子胚成熟后需要一個相對干燥的生長環(huán)境，因此可通過改變水勢對胚狀體產(chǎn)生一定的水分脅迫作用，從而提高再生植株的質(zhì)量和成苗率。

3.3 再生植株的倍性鑒定

小孢子培養(yǎng)誘導的胚狀體得到的再生植株通常為單倍體。然而紅菜薹在培養(yǎng)過程中有較高的自然加倍的現(xiàn)象，從而導致再生植株倍性復雜，并非都是單倍體。因此，為了確定再生植株的倍性情況，對產(chǎn)生的植株進行倍性鑒定很有必要。目前一般通過以下幾種方法對再生植株進行倍性鑒定。

①形態(tài)學鑒定 從植株的外部形態(tài)特征可以快速鑒定作物的倍性，一般來說單倍體植株個體比二倍體小，植株生長勢也要弱些；通過觀察花培植株的花器官形態(tài)也可鑒別植株的倍性，單倍體植株為高度不育。

②解剖學鑒定 通過分析葉片保衛(wèi)細胞中葉綠體數(shù)目來鑒定植株的倍性，單倍體植株保衛(wèi)細胞中葉綠體數(shù)目比二倍體植株少得多，且差值不受基因型的影響。也可通過比較植株氣孔大小的差異來鑒定植株的倍性，同部位單倍體植株的氣孔長度、寬度和周長均小于二倍體植株的。

③細胞學鑒定 細胞學鑒定植株倍性的方法是根尖壓片法，紅菜薹單倍體的染色體數(shù)目為10條（n=x=10），二倍體為20 條（2n=2x=20）。如果觀察到花培得到植株的根尖染色體數(shù)為體細胞的1/2，即可確定花培植株是單倍體。

④DNA含量的測定 流式細胞儀（DNA flow cytometry）可以快速準確地測定植株DNA含量，從而確定植株的倍性，準確率可達99%以上。如果花培得到的植株DNA含量為二倍體植株的1/2，則可確定再生植株是單倍體。

3.4 再生植株的染色體加倍

可通過對小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體植株進行染色體加倍獲得雙單倍體（即DH）。由小孢子培養(yǎng)得到的單倍體植株有自然加倍的現(xiàn)象，但不同植物加倍的比例有差異，所以對單倍體植株進行人工加倍也是很有必要的。

張建軍等[15]將不同材料接種在含秋水仙素的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)可提高人工誘導葉菜類四倍體的效率，且未發(fā)現(xiàn)倍性嵌合體，認為通過組織培養(yǎng)方法誘導加倍效果比常規(guī)誘導加倍效果好。丁瑜等[16]采用秋水仙素浸泡油菜小孢子培養(yǎng)獲得的再生單倍體植株根系的方法，使二倍體數(shù)從45%提高到75%。在紅菜薹上，還未見有利用含秋水仙素的固體培養(yǎng)基對其進行染色體加倍的報道。由于花培得到的胚狀體再生植株均為無菌苗，如果采用根尖浸泡和植株生長點滴定的方式加倍，需要多次滴定，操作上比較繁瑣，且容易出現(xiàn)組培苗被感染或死亡的危險。因此，采用含秋水仙素的培養(yǎng)基培養(yǎng)單倍體進行加倍的方法，在成功加倍單倍體的同時會增加植株感染的風險，另外，添加秋水仙素的具體濃度尚不清楚。

4 近年來小孢子培養(yǎng)在育種上的應用

謝冰等[17]對小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的西葫蘆DH群體進行研究發(fā)現(xiàn)，其DH群體遺傳多樣性豐富，有明顯的超親優(yōu)勢，有利于篩選出優(yōu)異的自交系。姚星偉等[18]的研究也表明，供體雙親的性狀決定了后代群體性狀的分離程度，雙親差異程度越大，DH群體分離類型越多，選擇效率越好。陳斌等[19]從辣椒DH群體中分離出抗TMV和CMV的超親抗病資源。李真等[20]從甘藍型油菜DH群體中獲得極端抗旱基因型和極端不抗旱基因型，為抗旱相關研究及育種提供了材料。河南省農(nóng)科院通過小孢子培養(yǎng)先后育成了豫生1號、豫新6號、豫新50、豫新60和豫新58等多個大白菜品種。北京市蔬菜研究中心也利用該技術育成了桔紅心大白菜等品種。而小孢子培養(yǎng)應用在紅菜薹育種上的文章鮮有見報，可能是由于紅菜薹為地方特色蔬菜，研究起步比較晚，難度較大，因此研究工作大多集中在胚狀體的誘導和植株成苗上。

5 存在的問題和展望

經(jīng)過20多a國內(nèi)外育種專家的共同探索，植物游離小孢子培養(yǎng)技術不斷改進，在某些植物上已經(jīng)形成了較為完善的技術體系。相對于其他作物而言，紅菜薹小孢子培養(yǎng)的出胚率比較低，很多基因型材料甚至不產(chǎn)胚、培養(yǎng)結(jié)果重復性差、胚狀體植株成苗效率不高、白化苗、玻璃化苗現(xiàn)象比較嚴重等，使其在育種中的應用具有一定的局限性，因此迫切需要提高小孢子培養(yǎng)技術的應用效率，建立完善、高效的紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術體系。

今后應在有機物、不同激素的最佳配比、培養(yǎng)方法改進、與易出胚品種雜交擴大基因型反應范圍等方面進一步研究，提高小孢子產(chǎn)胚率，減少畸形胚的發(fā)生，提高再生植株的成苗率，同時，將通過小孢子培養(yǎng)與分子生物學方法及植株遺傳學方法相結(jié)合，對胚狀體發(fā)生的分子調(diào)控機制進行研究，以期達到人工調(diào)控單倍體培養(yǎng)的目的，從而建立高效、穩(wěn)定的獲得DH群體的游離小孢子培養(yǎng)技術體系。

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