李學(xué)朋等

【摘要】 目的：試通過對去卵巢大鼠不同時期骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)的檢測，為補腎活血方治療骨質(zhì)疏松癥提供實驗依據(jù)。方法：將雌性大鼠30只隨機分為3組：去卵巢對照組、補腎活血方實驗組，假手術(shù)對照組共3組，每組10只。每周稱量體重1次。動物飼養(yǎng)13周后，處死，剝離左、右側(cè)股骨，剔除干凈骨周圍附著軟組織，測定骨恒重和骨鈣。取大鼠右側(cè)股骨在105 ℃烘箱中烘干至恒重后（間隔1 h稱量差值不超過0.0003 g），稱量骨干重。原子吸收法測定右側(cè)股骨鈣含量。測量左側(cè)股骨全長，以雙能X線吸收骨密度儀（DEXA）測定股骨中點、遠(yuǎn)心端和近心端骨密度。并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：去卵巢動物體重均明顯高于假手術(shù)對照組（P<0.05）。補腎活血方實驗組大鼠右側(cè)股骨恒重明顯高于去卵巢對照組和假手術(shù)對照組（P<0.05）；補腎活血方實驗組和假手術(shù)對照組大鼠股骨鈣含量明顯高于去卵巢對照組（P<0.05）。去卵巢對照組大鼠左側(cè)股骨中點、遠(yuǎn)心端和近心端骨密度均明顯低于假手術(shù)對照組（P<0.05），表明本實驗大鼠骨密度低下模型成功。結(jié)論：比較各組骨密度結(jié)果表明，補腎活血方實驗組股骨中點、遠(yuǎn)心端、股骨近心端骨密度均高于去卵巢對照組，且比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。補腎活血方實驗組股骨長度亦明顯高于去卵巢對照組（P<0.05）。

【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松癥； 中醫(yī)藥療法； 骨鈣； 骨密度； 實驗研究； 大鼠

補腎活血方為新泰孟氏醫(yī)院孟照明教授的經(jīng)驗方，為純中藥制劑，其主要功能為調(diào)整骨代謝，治療骨質(zhì)疏松。處方成分主要由熟地、杜仲、山藥、巴戟天、肉蓯蓉、牛膝、枸杞、桃仁、紅花、赤芍、川芎、當(dāng)歸、血竭等20味藥物組成。骨質(zhì)疏松癥是目前隨著人口老齡化而增長并且逐漸危及到人們健康的一種疾病。為此，通過建立動物實驗?zāi)Ｐ停瑢θヂ殉泊笫蟛煌瑫r期骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)進行檢測，以期探討補腎活血方對骨質(zhì)疏松癥的治療預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 受試物 補腎活血方，由新泰孟氏骨科研究所提供。性狀：中藥湯劑，供實驗用。人體推薦攝入量：1劑/d，煎至300 ml，分早晚2次服用。

l.2 實驗動物 SPF級健康成年10 周齡SD大鼠，雌性，30只，體重250～300 g。由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK2006-0008。動物使用許可證：SYXK20uo-0025，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，實驗環(huán)境溫度23～24 ℃，濕度54%～58%。

1.3 動物飼料 參照AIN93飼料配方配制半成品飼料，用適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)替換飼料中來源于大豆的成分，以避免大豆異黃酮等植物雌激素對實驗結(jié)果的干擾（主要成分為23%酪蛋白，32%玉米淀粉，30%蔗糖，5%纖維，5%玉米油，3.5%混合礦物鹽1，1%混合維生素2，0.3%DL-蛋氨酸，0.2%酒石酸膽堿）。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006-0003。飼料中鈣含量為153 mg/100 g。

1.4 主要儀器設(shè)備 雙能X線吸收骨密度儀（DEXA，美國NORLAND公司生產(chǎn)的XR.36型）；原子吸收分光光度計（PE股份有限公司生產(chǎn)，PE-2eemam-5100型）。

1.5 試驗方法 按照衛(wèi)生部《藥品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）“增加骨密度功能檢驗方法”進行。

1.5.1 手術(shù)處理及動物分組 SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為去卵巢組和假手術(shù)對照組。大鼠經(jīng)腹腔注射40 mg/（kg·bw）戊巴比妥鈉溶液（1%）麻醉，固定，經(jīng)背部肋脊角切口行卵巢切除術(shù)；假手術(shù)組切除卵巢周圍部分脂肪，然后對切口分層縫合。術(shù)后10 d，按體重將去卵巢動物隨機分為去卵巢對照組、補腎活血方組，計入假手術(shù)對照組共3組，每組10只。

1.5.2 劑量選擇及受試物給予方式 補腎活血方5.00 ml/（kg·bw），作為補腎活血方組。實驗期間各組動物喂飼基礎(chǔ)飼料，自由攝食和飲用去離子水。試驗組分別灌胃給以補腎活血方受試物，去卵巢對照組和假手術(shù)對照組灌胃給以去離子水。灌胃量為10 ml/（kg·bw），每日灌胃1次，共13周。

1.6 觀察指標(biāo) 體重：每周稱量1次。骨恒重和骨鈣測定：動物飼養(yǎng)13周后，處死，剝離左、右側(cè)股骨，剔除干凈骨周圍附著軟組織。取大鼠右側(cè)股骨在105 ℃烘箱中烘干至恒重后（間隔1 h稱量差值不超過0.0003 g），稱量骨干重。原子吸收法測定右側(cè)股骨鈣含量。骨密度測定：測量左側(cè)股骨全長，以雙能X線吸收骨密度儀（DEXA）測定股骨中點、遠(yuǎn)心端和近心端骨密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析和雙因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，組間比較采用LSD-t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試物對大鼠體重的影響 去卵巢動物體重均明顯高于假手術(shù)對照組（P<0.05）。實驗初始（0周）補腎活血方實驗組動物體重與去卵巢對照組相比，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；實驗結(jié)束時（第13周末）補腎活血方實驗組大鼠體重均明顯低于去卵巢對照組（P<0.05）。見表1。

2.2 受試物對大鼠股骨恒重和骨鈣含量的影響 補腎活血方實驗組大鼠右側(cè)股骨恒重明顯高于去卵巢對照組和假手術(shù)對照組（P<0.05）；補腎活血方實驗組和假手術(shù)對照組大鼠股骨鈣含量明顯高于去卵巢對照組（P<0.05）。見表2。

2.3 受試物對大鼠骨密度的影響 去卵巢對照組大鼠左側(cè)股骨中點、遠(yuǎn)心端和近心端骨密度均明顯低于假手術(shù)對照組（P<0.05），表明本實驗大鼠骨密度低下模型成功。比較各組骨密度結(jié)果表明，補腎活血方實驗組股骨中點、遠(yuǎn)心端、股骨近心端骨密度均高于去卵巢對照組，且比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。補腎活血方實驗組股骨長度亦明顯高于去卵巢對照組（P<0.05）。見表3、4。

經(jīng)口連續(xù)13周每天給以去卵巢模型大鼠補腎活血方5.00 ml/（kg·bw），結(jié)果表明，補腎活血方實驗組大鼠股骨中點、股骨遠(yuǎn)心端、股骨近心端骨密度均明顯高于去卵巢對照組（P<0.05）；補腎活血方實驗組大鼠股骨鈣含量也高于去卵巢對照組（P <0.05）。

3 討論

建立去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型研究骨質(zhì)疏松癥已得到公認(rèn)，并已經(jīng)被廣泛采用[1]。雌性大鼠在卵巢切除后松質(zhì)骨骨量減少，骨的強度下降，某些部位骨丟失現(xiàn)象加快，這種特征與人正常絕經(jīng)后高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松發(fā)生的骨丟失現(xiàn)象相類似[2]。本實驗研究中，去卵巢大鼠體重均明顯高于假手術(shù)對照組，補腎活血方試驗組大鼠右側(cè)股骨恒重明顯高于去卵巢對照組和假手術(shù)對照組，補腎活血方試驗組和假手術(shù)對照組大鼠股骨鈣含量明顯高于去卵巢對照組，去卵巢對照組大鼠左側(cè)股骨中點、遠(yuǎn)心端和近心端骨密度均明顯低于假手術(shù)對照組，表明本實驗大鼠骨密度低下模型成功。成年大鼠骨重建周期為30～40 d，為了得到更加明顯的實驗結(jié)果，本研究將補腎活血方的治療時間定為13周。在本實驗中補腎活血方組大鼠體重均與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示補腎活血方可能不具有雌激素的抗體重增加作用，但其理論依據(jù)還需進一步探討。本研究結(jié)果表明，大鼠給予補腎活血方后，骨恒重和骨鈣含量明顯增高，股骨中點、遠(yuǎn)心端、股骨近心端骨密度均高于去卵巢對照組，說明補腎活血方可促進骨形成，使骨形成大于骨吸收，以治療骨質(zhì)疏松的發(fā)生。反映了中藥補腎活血方可以提高成骨細(xì)胞活性，使骨生長增強，有效治療去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥。

骨質(zhì)疏松是以骨量減少和骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)退化（松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)、斷裂數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄）為特征的，導(dǎo)致骨的脆性增加以及骨折危險增加的一種全身骨骼疾病。骨質(zhì)疏松最終會導(dǎo)致骨折，特別是椎體、髖部股骨頸、轉(zhuǎn)子間、橈骨遠(yuǎn)端與肱骨近端[3]。中醫(yī)以為骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”和“骨痹”的范疇，《內(nèi)經(jīng)》云：“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”?！夺t(yī)經(jīng)精義》亦云：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也；髓者精之所升也，精足則髓足。髓在骨內(nèi)，髓足則骨強”。根據(jù)“腎藏精，主骨生髓”的理論，對骨質(zhì)疏松的治療主要以補腎中藥為主，而在補腎藥中又以補益藥中的補陽藥物為最多。多數(shù)學(xué)者以“腎主骨”理論為指導(dǎo)[4]，對中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥進行了大量的臨床與實驗研究，取得了較好的效果，也進一步加深了中醫(yī)對本病的認(rèn)識：本病病因病機的關(guān)鍵在于各種原因所致的腎虛，屬本虛標(biāo)實，病位在腎，與肝、脾有關(guān)。本虛以腎（氣、陰、陽）為主，涉及肝陰、脾氣及氣血不足；標(biāo)實多為瘀血[5]。補腎活血方以熟地、杜仲為君藥。熟地性甘，微溫；歸肝、腎經(jīng)；具有養(yǎng)血滋陰，補精益髓之功效。杜仲，性甘、溫，歸肝、腎經(jīng)；具有補肝腎，強筋骨之功效。以巴戟天、肉蓯蓉、牛膝、骨碎補、川芎、當(dāng)歸、桃仁、紅花為臣藥，山藥、枸杞、赤芍、血竭、三七、續(xù)斷、茯苓、黃芪、木香、陳皮為佐使藥。共奏補腎活血，強筋壯骨，益氣健脾，活血通絡(luò)之功。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補腎藥物中含有類雌二醇樣物質(zhì)[6]，可能顯著提高雌性大鼠體內(nèi)的雌激素水平。同時，續(xù)斷，杜仲等補腎中藥中含有黃酮類物質(zhì)，與己烯雌酚有相類似的結(jié)構(gòu)，從而具有雌性激素樣作用[7]，可以促進成骨細(xì)胞分化和增殖[8]。補腎活血方對于骨質(zhì)疏松癥有明顯的預(yù)防及顯著的治療作用，同時，避免了單純的抗骨吸收藥物在降低骨轉(zhuǎn)換率的同時也部分抑制了成骨細(xì)胞活性的缺點，為中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥開辟了一條新思路，開發(fā)前景廣闊。

參考文獻

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（收稿日期：2012-11-12） （本文編輯：李靜）