張齊雄，陳 剡

(西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715)

黃芩苷(HL)作為從中藥黃芩的根中提取分離出來的一種主要黃酮類化合物［1］，由黃芩素和糖基構(gòu)成，具有眾多的生物活性［2］。隨著對中藥有機(jī)活性成分和微量元素的深入研究［3］，以及受過渡金屬配合物生物活性增強(qiáng)的啟示［4，5］，人們已注意到中藥中的活性成分可能是有機(jī)成分與無機(jī)成分的協(xié)同作用。由此而建立的“中藥配位化學(xué)學(xué)說”［6］認(rèn)為:中藥有效成分不是單純的有機(jī)成分，也不是單純的微量元素，而是有機(jī)成分與微量元素組成的配位化合物。近40年來，國內(nèi)外學(xué)者對稀土元素生物效應(yīng)和藥用價值研究發(fā)現(xiàn):稀土元素既有成藥的可能［7，8］，同時也面臨著無機(jī)金屬離子的蓄積毒性［9，10］。

本文報道在堿性(NaHCO3)條件下，黃芩苷(HL，L=C21H17O11)與稀土金屬(Ln=Ce，Pr，Nd，Sm，Gd)鹽反應(yīng)合成了5個新型的黃芩苷稀土配合物L(fēng)nL3(Chart 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV，IR，MS和元素分析等表征。用 MTT法考察了 HL和LnL3抗人肝癌細(xì)胞HepG2活性;用UV光譜法研究了LnL3與小牛胸腺DNA(ctDNA)結(jié)合模式。

Chart 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

U-1800型紫外掃描儀;Perkin-Elmer FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片);Bruker HCT ESI-MS(300 MHz)型質(zhì)譜儀。

HL(純度＞95%，批號XC090722)，西安小草植物科技有限責(zé)任公司;胎牛血清，Gibco公司;胰蛋白酶，Amresco公司;其余所用試劑均為分析純;實驗用水為重蒸餾水。

1.2 LnL3的合成

在反應(yīng)瓶中加入HL 3 g(6.7 mmol)和水100 mL，攪拌下滴加等摩爾的1%NaHCO3溶液，滴畢，反應(yīng)10 min(使其完全溶解);按n(HL)∶n(Ln)=3∶1加入稀土硝酸鹽溶液，于60℃反應(yīng)約30 min。過濾，濾餅用蒸餾水洗滌數(shù)次，于50℃干燥得棕黑色金屬光澤固體LnL3。

1.3 LnL3對HepG2的抑制作用

取對數(shù)生長期的HepG2腫瘤細(xì)胞，用含10%胚牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×104個·mL-1，接種于 96 孔板內(nèi)，每孔 100 μL，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出并更換培養(yǎng)基，加入5個濃度(20，40，80，160，320)μmol·L-1的HL和 LnL3，每孔100 μL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，空白組只加培養(yǎng)基。繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT培養(yǎng)4 h，棄上清液后加入DMSO，振蕩并在酶標(biāo)儀上于570 nm處測定吸光度A。以溶劑對照組處理的腫瘤細(xì)胞為對照組，取5個復(fù)孔的平均值，計算抑制率{抑制率=［(1-A藥液)/A對照］×100%}。

1.4 LnL3與ctDNA相互作用

(1)DNA溶液的配置

稱取適量ctDNA溶于緩沖溶液［5 mmol·L-1Tris-50 mmol·L-1NaCl溶液，pH=7.1(HCl)］中，抽濾，DNA溶度用紫外分光光度法確定(波長為260 nm 時，根據(jù) ε260=6 600 L·mol-1·cm-1確定)，且經(jīng)UV測定A260/A280＞1.8，表示其中無蛋白質(zhì)。LnL3用DMSO溶解到需要濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用，且少量的DMSO對DNA無影響［11］。

(2)LnL3與ctDNA相互作用的UV譜圖

在參比池中加入5 mmol·L-1Tris緩沖溶液2 mL，樣品池中加入同體積的 1.0 ×10-4mol·L-1的ctDNA溶液，測定溶液在240 nm～310 nm處的吸收光譜;向樣品池中逐漸加入同體積的1.0 ×10-3mol·L-1的 HL 或 LnL3，測定 DNA 與其相互作用的UV譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 LnL3的結(jié)構(gòu)表征

(1)配合比例及收率

LnL3經(jīng)600℃灼燒2 h制得穩(wěn)定金屬氧化物，經(jīng)EDTA滴定測定，無論原料比例是多少，測得金屬含量均較穩(wěn)定，接近產(chǎn)物配合比例為3∶1的金屬含量。除Ce和Gd外，LnL3收率均較低，結(jié)果見表1。由表1可見，稀土元素種類、反應(yīng)摩爾比對該反應(yīng)過程及產(chǎn)物無影響，均得到配合比為3∶1的LnL3，具體原因尚需研究。收率較黃芩苷鑭和黃芩苷釔［12］低，原因可能是由于鑭和釔的次外層d軌道中僅有一個電子，很容易失去，為所有過渡金屬中金屬性最強(qiáng)的兩個元素，甚至接近堿土金屬，更易接受富電子配基。而Ce和Gd的電子排布分別為［Xe］4f15d16s2，［Xe］4f75d16s2，同樣存在外層d電子，具有d區(qū)過渡元素的性質(zhì)。而另三個稀土元素均不存在d電子，且f軌道的電子較d軌道難失去，故使得反應(yīng)較鑭釔鈰釓困難，產(chǎn)率降低。

表1 LnL3的實驗結(jié)果，IR和元素分析數(shù)據(jù)Table 1 Experimental results，IR and elemental analyses data of LnL3

表2 HL和LnL3的最大吸收波長和吸光度Table 2 The maximum absorption wavelength and absorbance of HL and LnL3

表3 HL和LnL3的ESI-MS數(shù)據(jù)Table 3 ESI-MS data of HL and LnL3

(2)IR和元素分析

HL和LnL3的IR數(shù)據(jù)見表1。推測HL的C=O上氧的孤對電子與金屬的空d或空f軌道形成了配位鍵導(dǎo)致了電子云更加偏向氧原子，使得C=O電子云密度降低，力場數(shù)變小，故LnL3(依次為 CeL3，PrL3，NdL3，SmL3和 GdL3，下同)的羰基伸縮振動吸收分別向低頻方向移動約52 cm-1，53 cm-1，55 cm-1，55 cm-1，55 cm-1;而LnL3較HL的O-H伸縮振動吸收峰發(fā)生了移動，分別向高波數(shù)方向移動約56 cm-1，61 cm-1，62 cm-1，66 cm-1，68 cm-1，說明了配位反應(yīng)使分子內(nèi)的氫鍵被破壞［13］;C-O中氧電子離域程度擴(kuò)大同樣使得該伸縮振動向低頻方向發(fā)生了微小移動;而在500 cm-1以下的低頻指紋區(qū)吸收可以認(rèn)為是稀土金屬-配位原子的伸縮振動和彎曲振動吸收，這也說明稀土元素與羰基氧進(jìn)行了配位。另一方面，酚羥基可能由于太靠近糖基，空間位阻太大，不能參與配位。

LnL3的元素分析數(shù)據(jù)見表1。由表1可見，C，H和O的分析數(shù)據(jù)與LnL3理論值非常接近，故可判斷系列LnL3分子式為Ln(C21H17O11)3，結(jié)構(gòu)式如Chart 1所示。

(3)UV分析

HL和LnL3均以相同摩爾濃度溶解于DMSO中，以DMSO為參比，經(jīng)UV測得HL在275 nm和316 nm處有兩個寬吸收峰，而LnL3在316 nm無吸收峰。HL和LnL3的最大吸收波長見表2。從表2可見，金屬具有一定吸電子作用，使電子躍遷激發(fā)能減小及整個分子的電子離域程度增大，LnL3均較HL的最大吸收波長發(fā)生了微弱紅移及減色效應(yīng)。反過來說，HL與稀土元素之間確實發(fā)生了螯合。

(4)MS分析

MS結(jié)果(圖3)中HL的分子離子峰為445，而LnL3則分別為1 474，1 475，1 478，1 484和1 491。主要碎片峰數(shù)據(jù)見表3。由表3可見，在CeL3和GdL3中出現(xiàn)967，1 299和1 317碎片峰，分別為分子離子斷裂失去1分子，2分子和3分子葡萄糖苷(175Da)所得到的碎片峰信號，由此可知，5種LnL3均為“3HL+Ln”組成。

2.2 抗HepG2細(xì)胞

HL和LnL3的抗腫瘤活性見表4。從表4可見，LnL3抗HepG2細(xì)胞的IC50值均較HL有了較大提高，其抗腫瘤活性順序為SmL3＞GdL3＞NdL3＞CeL3＞PrL3＞HL。

表4 HL和LnL3的HepG2細(xì)胞活性Table 4 Antineoplastic(HepG2)activities of HL and LnL3

2.3 HL和LnL3與DNA的相互作用

CeL3與DNA相互作用的UV譜圖見圖1。由圖1可見，隨著HL的加入DNA產(chǎn)生了明顯的減色效應(yīng)，而通常外來物與DNA的磷酸基團(tuán)相結(jié)合，使得DNA鏈的纏繞性增大，DNA趨于縮攏，一部分發(fā)色基團(tuán)被包裹，吸收躍遷偶極矩減小，使得發(fā)生減色效應(yīng);而微小紅移的出現(xiàn)，主要是因為HL插入后，其π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生電子堆積，能級下降，從而π→π*躍遷能減小，產(chǎn)生了紅移現(xiàn)象。減色紅移程度越大，表明插入作用程度越大。由圖1可見，HL與Ce形成配合物后，可能是金屬陽離子與帶負(fù)電的DNA作用，導(dǎo)致主鏈線電荷密度減小，纏繞增大，增強(qiáng)了與DNA的結(jié)合作用。

圖1 CeL3與DNA相互作用的UV譜圖Figure 1 UV spectra of the interaction between CeL3 and ctDNA

3 結(jié)論

合成了5個新型的黃芩苷稀土配合物L(fēng)nL3。用MTT法考察了 HL及 LnL3抗人肝癌細(xì)胞HepG2活性，結(jié)果表明LnL3對HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50)均較HL減少一半以上，LnL3具有較HL更好的抗腫瘤活性;用UV研究了LnL3與小牛胸腺DNA(ctDNA)結(jié)合模式，結(jié)果表明LnL3對HepG2的半數(shù)抑制能力均較HL高，與ctDNA可能以嵌插方式為主，可能正是由于這種插入鍵合的作用影響了 DNA的構(gòu)型，抑制了DNA分子的遺傳和復(fù)制，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。從DNA層面研究了系列黃芩苷稀土配合物抗腫瘤的可能原因，提示了稀土元素在腫瘤治療方面的藥用價值，為尋找新型的高效低毒抗腫瘤金屬配合物及傳統(tǒng)中藥的新開發(fā)提供了一定的參考。

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