葛付超,武慶杰,武星汝

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000)

實時熒光定量PCR檢測REST基因在小細胞肺癌組織中的表達及其臨床意義

葛付超,武慶杰,武星汝

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000)

目的探討REST基因在小細胞肺癌組織中的表達及其臨床意義。方法應(yīng)用實時熒光定量PCR對30例小細胞肺癌組織及癌旁組織中REST進行檢測。結(jié)果REST在小細胞肺癌組織中的表達水平0.596比正常肺組織0.949明顯降低(P＜0.05)，小細胞肺癌組織中REST的表達與腫瘤的分化程度及侵襲性有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論REST在小細胞肺癌組織中有低表達，可能參與小細胞肺癌的發(fā)病，可能有助于小細胞肺癌的早期診斷、治療及預(yù)后。

神經(jīng)元限制性沉默轉(zhuǎn)錄因子；小細胞肺癌；實時定量RT-PCR

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在世界上許多國家和地區(qū)，肺癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的首位。小細胞肺癌約占肺癌的20%，惡性程度高，倍增時間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛。Sutherland等研究發(fā)現(xiàn)成鼠肺癌細胞中的Trp53和Rb1失活，可使神經(jīng)內(nèi)分泌細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾〖毎伟┮虼苏J(rèn)為神經(jīng)內(nèi)分泌細胞是小細胞肺癌的主要起源細胞[1]。小細胞肺癌細胞中可見密集神經(jīng)分泌顆粒，內(nèi)含神經(jīng)內(nèi)分泌激素，使得小細胞肺癌與內(nèi)分泌和副腫瘤綜合征相關(guān)。神經(jīng)元限制性沉默轉(zhuǎn)錄因子（RE1-silencing transcription factor，REST)不僅在神經(jīng)元的發(fā)生和分化過程中起重要的調(diào)控作用[2]，而且可能還參與了細胞凋亡、基因復(fù)制、轉(zhuǎn)綠調(diào)控、血管形成、腫瘤形成等[3-4]。本文應(yīng)用實時熒光定量PCR對30例小細胞肺癌組織及正常癌旁組織中REST基因進行檢測，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1臨床資料

1.1一般資料新鮮小細胞肺癌組織和距癌組織30例邊緣3 cm以上的正常肺組織，取自2010年1月—12月青海大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科患者，標(biāo)本均經(jīng)病理證實。

1.2主要試劑及儀器TRIzoL試劑、RT-PCR反應(yīng)試劑盒(美國BD公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)，紫外分光光度計(美國Thermo公司)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 REST基因相對表達量的檢測

1.3.1引物和探針的設(shè)計與合成所有引物通過primer premier5.0軟件設(shè)計，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。REST：上游引物：5'-AGTGAAAGGGCACGGAAGG-3'；下游引物：5'-TGGCAGTGGTGGTGATGG-3'。擴增片段長度123bp。GAPDH：上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'；下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。擴增片段長度225bp。對不同引物序列進行預(yù)實驗，以保證目的基因與內(nèi)參基因擴增效率一致且均接近1。

1.3.2總RNA提取及cDNA合成取凍存組織約100mg，采用TRIzoL提取總RNA，紫外分光光度計測定吸光度A260/A280比值，明確RNA純度及濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實RNA完整。取總RNA2μg經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。反應(yīng)條件：37℃、65min，72℃、10min。

1.3.3實時熒光定量RT-PCR每一樣品均設(shè)2個重復(fù)孔，反應(yīng)體系均為10μL，反應(yīng)條件：94℃變性20 s、95℃5 s、60℃40 s，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)。每次PCR反應(yīng)后均進行熔解曲線分析以確認(rèn)擴增產(chǎn)物的特異性。

1.3.4 REST家族基因mRNA表達水平相對定量分析采用2-△△Ct法[5]，計算REST基因表達量，即以GAPDH為內(nèi)參照基因，計算各樣品△Ct(RESTCt-GAPDHCt)，設(shè)定△Ct值最大的正常對照為校正樣品，計算△△Ct(各樣品△Ct-校正品△Ct)，某樣品的REST基因mRNA相對表達量(RQ)可用如下公式計算：RQ=2-△△Ct。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用±s表示，REST基因表達水平差異分析采用配對t檢驗。REST基因與臨床病理特征的關(guān)系分析采用獨立樣本t檢驗。

2結(jié)果

2.1 REST基因在小細胞肺癌組織中的表達小細胞肺癌組織中REST基因mRNA水平(0.596±0.143)低于癌旁組織(0.949±0.270)，兩者差異具有顯著性(P＜0.05),見圖1。

2.2 REST基因與臨床病理特征的關(guān)系小細胞肺癌中RESTmRNA的表達與癌細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有關(guān)，而與性別、年齡無關(guān)。高/中分化小細胞肺癌高于低分化小細胞肺癌者（0.814±0.266/0.608±0.179）,P＜0.05；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小細胞肺癌REST-mRNA表達水平低于無轉(zhuǎn)移者（0.564±0.236/0.828±0.207）,P＜0.05；TNM分期Ⅰ+Ⅱ的小細胞肺癌表達水平明顯高于Ⅲ+Ⅳ小細胞肺癌（0.842±0.192/0.568±0.264），P＜0.05。而男、女（0.675±0.232/0.698±0.187）及大于60歲、60歲以下(0.721±0.265/0.671±0.178)REST-mRNA表達均無明顯差異（P＞0.05）。

3討論

小細胞肺癌作為一種侵襲性疾病，疾病進展較快，易發(fā)生較早轉(zhuǎn)移，在過去的30年中，小細胞肺癌的研究及治療幾乎沒有進展，其發(fā)生發(fā)展是多基因參與的多步驟、多階段、多環(huán)節(jié)、多因素，涉及到細胞內(nèi)眾多分子事件的復(fù)雜過程。抑癌基因的缺失和（或）突變及轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系的異常是導(dǎo)致小細胞肺癌發(fā)生的主要原因。目前研究表明與小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后密切相關(guān)的基因包括癌基因p53、RB基因，癌基因Bcl-2、Myc基因及PI3K/AKT/ mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。故對小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中相關(guān)基因異常的認(rèn)識是小細胞肺癌防治的關(guān)鍵。小細胞肺癌具有異質(zhì)性，其細胞起源目前尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)，小細胞肺癌起源于支氣管黏膜或腺上皮內(nèi)的Kulchitsky細胞（嗜銀細胞），屬APUD（amine precursor uptake decarboxylation）瘤[7]。但Park等[8]通過建立鼠小細胞肺癌模型研究發(fā)現(xiàn)，小細胞肺癌可能起源于支氣管黏膜上皮中可向神經(jīng)內(nèi)分泌分化的干細胞。

REST于1995年首次由Mandel實驗室發(fā)現(xiàn)。REST蛋白含九個鋅指結(jié)構(gòu)，作為一個抑制轉(zhuǎn)錄因子，REST氨基端的八個鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成REST的DNA結(jié)構(gòu)域，可以與目標(biāo)基因調(diào)節(jié)區(qū)域中的抑制元件位點結(jié)合而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。REST通常在非神經(jīng)元細胞核未成熟的神經(jīng)細胞中表達，它是抑制細胞中神經(jīng)元相關(guān)基因表達的關(guān)鍵因子，其作用是阻止細胞向神經(jīng)元方向分化[9]。而當(dāng)神經(jīng)前體細胞開始向神經(jīng)細胞分化時，REST蛋白的表達開始逐漸下降，當(dāng)細胞完全分化為成熟的神經(jīng)元細胞后，REST幾乎無表達[10]。基于REST在抑制細胞向神經(jīng)元方向分化、抑制神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)基因表達方面的重要作用，可以推斷在腫瘤細胞內(nèi)REST功能缺失可能是引起腫瘤出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌分化的原因之一，從而進一步影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示，在小細胞肺癌組織中，REST的表達明顯低于癌旁組織，考慮REST可能通過喪失對干細胞向神經(jīng)細胞方面分化的抑制作用而參與小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展。提示針對REST的靶向治療，可能為小細胞肺癌的治療提供新的治療方向。本研究還顯示，REST基因的表達與癌細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有關(guān)，提示REST基因的檢測可能在小細胞肺癌的臨床分期和預(yù)后中有一定的臨床意義。

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Detection and Clinical Significance of REST in Sm all Cell Lung Cancer by Real-tim e Quantitative PCR

Ge Fuchao,W u Qingjie,W u X ingru
（Heze MedicalCollege,Heze 274000,Shandong）

Ob jectiveTo explore the clinicalsignificance of REST expression in small cell lung cancer.M ethodsThe real-time quantitative RT-PCR wasused to detect the expression of RESTmRNA in 30 patientsw ith small cell lung cancer and their normal transitional cell tissues.Resu ltsThe expression of RESTmRNA in the small cell lung cancer tissues(0.596)was significantly down-regulated than that in the normal transitional cell tissues(0.949).The expression RESTmRNA in well-moderated differentiation small cell lung cancerwere higher than those in poor differentiation small cell lung cancer(P＜0.05).ConclusionThere isaberrantexpression of REST in small cell lung cancer.They are involved in the pathogenesisof small cell lung can cer.To detect theexpression of RESTmRNA may be a reliablemeans for early diagnosis,treatmentand prognosisof small cell lung cancer.

RE-silencing transcription factor;Small cell lung cancer;Real-time quantitative PCR

R.3647

：A

：1008-4118（2013）02-0008-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.02.03

2013-03-29