石杰

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一種多年生豆科牧草植物，根狀莖發(fā)達(dá)，枝葉繁茂，能覆蓋地面、減少蒸發(fā)、保蓄水分，減輕地表沖刷。有資料顯示，2～4年生的紫花苜蓿植株每公頃每年可固氮150～450kg，根系腐爛后可增加土壤有機(jī)質(zhì)，改善物理性狀，提高土壤肥力。我國(guó)北方干旱地區(qū)實(shí)行糧食作物與紫花苜蓿輪作，更有利于提高糧食產(chǎn)量［1］。

根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際、莖葉的一類可促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益菌類［2，3］。根際有益細(xì)菌能夠促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，或者產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的代謝物，甚至抑制有害微生物。固氮菌、解磷細(xì)菌、解鉀細(xì)菌是具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的PGPR，是微生物肥料的核心，通過(guò)代謝可增加土壤中N、P、K及抗菌素、生長(zhǎng)素含量，或促進(jìn)土壤中一些有效性低的營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，或兼有刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程及防治病蟲害作用。

然而，微生物在根圈的定殖很大程度上依賴于作物根的分泌物和溢出物，因而植物會(huì)影響到根圈微生物的群落組成和定殖，而它們特定的分泌物又可以作為化學(xué)信號(hào)分子而同微生物相互作用。一般而言，土壤以其物化特性和存在的土著微生物群體這兩種方式來(lái)影響接種的微生物的定殖。同時(shí)，土壤中存在的土著微生物群體可能已經(jīng)建立了穩(wěn)定的互作作用，這種互作作用又可能受到接種微生物添加的影響。已有研究表明，植物根圈土壤施入有益微生物后，可促進(jìn)或抑制某些微生物的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)微生物區(qū)系，改善微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。研究使用根際促生菌增加退化土壤的微生物活性，改變退化土壤的結(jié)構(gòu)組成，達(dá)到改良退化土壤的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物

“三得利”為美國(guó)引進(jìn)品種，購(gòu)買自甘肅省草原總站草業(yè)中心(發(fā)芽率:85.4%)。

1.1.2 供試菌株

苜蓿根瘤菌菌株91522(Rhizobium meliloti 91522)［4］;

巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium，中國(guó)菌保中心菌株號(hào)ACCC 10008);

聯(lián)合固氮菌(Associative-nitrogen-fixing Bacterium)［5］;

鉀細(xì)菌(Bacillus mucilaginosus，膠質(zhì)芽孢桿菌，西南大學(xué)微生物研究中心分離);

纖維素分解菌菌株1306(Cellulose-Degradation Fungi 1306)［6］。

1.1.3 培養(yǎng)基(液)

根瘤菌采用改進(jìn)的YMA培養(yǎng)基(液)，固氮培養(yǎng)基(液)，硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基(液)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(液)，察氏培養(yǎng)基(液)，高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

1.1.4 鈣溶液

使用氯化鈣溶液配制成5mmol/L。

1.1.5 試驗(yàn)土壤

來(lái)源于西南大學(xué)水土保持實(shí)驗(yàn)室經(jīng)水土流失模擬試驗(yàn)所獲得的土壤，pH7.7，有機(jī)質(zhì)7.27g/kg，全氮0.537g/ kg，全磷0.506mg/kg，全鉀20.4g/kg，堿解氮40.3mg/kg，有效磷6.7mg/kg，速效鉀93.3mg/kg;細(xì)菌2.28 E+05 CFU/ gsoil，真菌4.00 E+02 CFU/gsoil，硅酸鹽細(xì)菌7.70 E+03 CFU/gsoil，固氮菌2.85 E+03 CFU/gsoil，根瘤菌6.00 E+ 01 CFU/gsoil，放線菌5.90 E+03 CFU/gsoil。

1.2 方法

1.2.1 菌株的準(zhǔn)備

取生長(zhǎng)于斜面上的苜蓿根瘤菌株91522一支，用5 mL無(wú)菌水洗下菌體，取1 mL接種于100 mL中性YMA培養(yǎng)液中，28℃置恒溫震蕩器中培養(yǎng)約24～26 h，調(diào)節(jié)其OD600值約為1.0后經(jīng)4000 rpm 20 min收集菌體，重新懸浮于新鮮YMA液體培養(yǎng)基中，加1%羧甲基纖維素納溶液作為黏著劑［7］，用于拌種。將巨大芽孢桿菌，聯(lián)合固氮菌，鉀細(xì)菌，纖維素分解菌菌株1306活化后培養(yǎng)其相應(yīng)的菌懸液。接種環(huán)接種，培養(yǎng)箱培養(yǎng)至各菌懸液活菌體濃度約為106個(gè)/mL。根據(jù)田間最大持水量，確定各處理的最大施菌量。

1.2.2 紫花苜蓿種子的制備

挑選均勻飽滿的健壯的苜蓿種子，于50℃～60℃水中浸泡0.5h，撈出，白天放在陽(yáng)光下曝曬，夜間轉(zhuǎn)至陰涼處，并加水保持種子濕潤(rùn)，當(dāng)大部分種子略有膨脹時(shí)用根瘤菌拌種。

1.2.3 土壤性狀測(cè)定方法

全氮:蒸餾法;

堿解氮:擴(kuò)散法;

全磷和有效磷:鉬藍(lán)比色法(660 nm比色);

全鉀和有效鉀:火焰光度法(6400型火焰光度計(jì));

有機(jī)質(zhì):重鉻酸鉀消煮法;

交換性酸:滴定法;

土壤微生物數(shù)量:稀釋平板法。

1.2.4 盆栽管理

1)苗期施鈣:苗期施鈣一次，施用5mmol/L CaCl2溶液均勻撒入各個(gè)盆栽。

2)栽培管理:取風(fēng)干土樣過(guò)3mm篩，每盆精確裝入6kg土樣，澆透水放置一晚后播種，每盆五穴，每穴播六顆種子。栽培期間澆水、除雜草。待種子均發(fā)芽之后按設(shè)計(jì)方案施入巨大芽孢桿菌、固氮菌、鉀細(xì)菌菌懸液。每月同一天取樣一次，取樣后施入相應(yīng)的新菌懸液，空白處理只澆水。

1.2.5 收后處理

分別于種植紫花苜蓿后的第一個(gè)月，第二個(gè)月，第三個(gè)月和第五個(gè)月取土樣，測(cè)定其化學(xué)和生物變化。第五個(gè)月收獲植株，將進(jìn)入生殖生長(zhǎng)的紫花苜蓿植株剪碎，拌入土中、施用相應(yīng)水平的纖維素分解菌菌懸液，原位土漚熟兩個(gè)月，其間定時(shí)加水，使土樣保持濕潤(rùn)，之后，再次取樣進(jìn)行各個(gè)化學(xué)和微生物指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.6 試驗(yàn)因子設(shè)計(jì)

采用四因素三水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)法(如表1)，四因素分別是施用巨大芽孢桿菌(A)、聯(lián)合固氮菌(B)、硅酸鹽細(xì)菌(C)和纖維素分解菌(D)，三個(gè)水平分別是:水平一是施用該菌株的滅菌的菌懸液15mL、水平二是使用該菌株的活體菌懸液15mL，水平三是使用該菌株的活體菌懸液30mL。共九個(gè)處理，重復(fù)三次。

表1 正交設(shè)計(jì)方案L9(34)Tab.1 Orthogonal design L9(34)

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖分析，LSD法作多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用固氮菌菌懸液對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

如表2所示，測(cè)定的各個(gè)微生物數(shù)量指標(biāo)在每個(gè)采樣期均有穩(wěn)定增加。第一個(gè)月中，施用聯(lián)合固氮菌菌懸液比不施用對(duì)細(xì)菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量有顯著增加的作用，其中施用30mL聯(lián)合固氮菌的菌懸液對(duì)細(xì)菌總數(shù)的提高影響達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)，第二個(gè)月同樣達(dá)到了顯著水平，且比第一個(gè)月的細(xì)菌總數(shù)也有明顯提高，第三個(gè)月各個(gè)處理的細(xì)菌總數(shù)基本達(dá)到了正常的穩(wěn)定水平，這說(shuō)明施用聯(lián)合固氮菌對(duì)退化土壤的細(xì)菌總數(shù)具有速效提高的作用。施用纖維素分解菌漚熟兩個(gè)月后施用了聯(lián)合固氮菌處理的細(xì)菌總數(shù)還處于兩個(gè)月前的水平，而不施用聯(lián)合固氮菌的處理則比漚熟前降低了一個(gè)多單位，這說(shuō)明施用聯(lián)合固氮菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對(duì)維持退化土壤的細(xì)菌總數(shù)的正常水平有重要作用。

表2 施用固氮菌菌懸液對(duì)退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.2 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Associative-nitrogen-fixing Bacterium(logCFU·g-1dry soil)

2.2 施用巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

如表3所示，測(cè)定的各個(gè)微生物數(shù)量指標(biāo)在每個(gè)采樣期均有穩(wěn)定增加。第一個(gè)月中，施用30mL巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)細(xì)菌總數(shù)的提高影響達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)，施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)固氮菌、根瘤菌、真菌數(shù)量的提高影響達(dá)到了顯著水平，施用滅菌的巨大芽孢桿菌菌懸液比活體菌懸液對(duì)提高退化土壤硅酸鹽細(xì)菌和放線菌的數(shù)量更有利。第二個(gè)月施用巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)各個(gè)微生物指標(biāo)的提高也有顯著作用。其中施用30mL巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)退化土壤的細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量、根瘤菌數(shù)量的提高達(dá)到了顯著水平，施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)退化土壤放線菌、真菌數(shù)量的提高達(dá)到顯著水平。施用滅菌的巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)退化土壤的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的提高有顯著作用。第三個(gè)月各個(gè)處理的微生物指標(biāo)基本達(dá)到了正常的穩(wěn)定水平，這說(shuō)明施用巨大芽孢桿菌對(duì)退化土壤的微生物指標(biāo)有速效提高的作用。施用纖維素分解菌漚熟兩個(gè)月后施用了巨大芽孢桿菌處理的各微生物指標(biāo)還處于兩個(gè)月前的水平，而不施用聯(lián)合固氮菌的處理則比漚熟前有所降低，這說(shuō)明施用巨大芽孢桿菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對(duì)維持退化土壤的細(xì)菌總數(shù)的正常水平有重要作用。退化土壤各處理的硅酸鹽數(shù)量又降回到原樣的水平。

表3 施用巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.3 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Bacillus megaterium(logCFU·g-1dry soil)

2.3 施用硅酸鹽細(xì)菌菌懸液對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

如表4所示，測(cè)定的各個(gè)微生物數(shù)量指標(biāo)在每個(gè)采樣期均有穩(wěn)定增加。第一個(gè)月中，施用15mL和30mL硅酸鹽菌懸液對(duì)硅酸鹽細(xì)菌總數(shù)的提高影響達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)，對(duì)其他微生物指標(biāo)沒(méi)有顯著影響。第二個(gè)月施用硅酸鹽細(xì)菌菌懸液對(duì)退化土壤細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量、根瘤菌數(shù)量、真菌數(shù)量的提高有顯著作用。第三個(gè)月各個(gè)處理的微生物指標(biāo)基本達(dá)到了正常的穩(wěn)定水平，這說(shuō)明施用硅酸鹽細(xì)菌對(duì)退化土壤的微生物指標(biāo)有速效提高的作用。但放線菌和真菌數(shù)量在各處理之間有顯著差異。施用纖維素分解菌漚熟兩個(gè)月后施用了硅酸鹽細(xì)菌處理的個(gè)微生物指標(biāo)還處于兩個(gè)月前的水平，而不施用硅酸鹽細(xì)菌的處理則比漚熟前有所降低，這說(shuō)明施用硅酸鹽細(xì)菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對(duì)維持退化土壤的細(xì)菌總數(shù)的正常水平有重要作用。退化土壤各處理的硅酸鹽數(shù)量又降回到原樣的水平。

表4 施用硅酸鹽細(xì)菌菌懸液對(duì)退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.4 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Bacillus mucilaginosus(logCFU·g-1dry soil)

2.4 施用纖維素分解菌菌懸液對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

使用纖維素分解菌對(duì)保持退化土壤的細(xì)菌、固氮菌、根瘤菌放線菌和真菌數(shù)量有顯著作用。對(duì)硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有較大影響(表5)。從表5可以看到固氮菌與纖維素分解菌的相互作用非常顯著，施用15mL纖維素分解菌菌懸液對(duì)保持固氮菌和根瘤菌數(shù)有顯著作用。

表5 施用纖維素分解菌菌懸液對(duì)退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.5 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Cellulose-Degradation Fungi(logCFU·g-1dry soil)

2.5 各個(gè)微生物指標(biāo)的相關(guān)性研究

對(duì)退化土樣中各個(gè)微生物指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系分析表明(表6)，在沙化的退化土壤中固氮菌的數(shù)量越多，則細(xì)菌總數(shù)越多，即細(xì)菌總數(shù)與固氮菌數(shù)量成顯著相關(guān)關(guān)系，也就是說(shuō)，促進(jìn)土壤固氮菌數(shù)量的提高有利于土壤中細(xì)菌總數(shù)的提高。退化土壤中根瘤菌數(shù)量與固氮菌數(shù)量也有顯著相關(guān)的關(guān)系，這與兩者的生長(zhǎng)基質(zhì)相似有關(guān)。真菌和細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量和根瘤菌數(shù)量有一定的相關(guān)，但不顯著。

表6 施入根際有益微生物后退化土壤中各微生物指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系分析r0.05=0.632Tab.6 Analysis of the correlation among microbial indicators in degradation soil by using PGPR r0.05=0.632

2.6 正交設(shè)計(jì)直觀分析

如表7，通過(guò)對(duì)多個(gè)響應(yīng)指標(biāo)的飽和正交分析，可以看出:能夠提高細(xì)菌數(shù)量的組合是A1B1C3D2(字母代表因素，數(shù)字代表水平)，能夠提高硅酸鹽數(shù)量的組合是A3B2C1D1，能夠提高固氮菌數(shù)量的組合是A1B2C1D2，能夠提高根瘤菌數(shù)量的組合是A2B2C2D3，能夠提高放線菌數(shù)量的組合是A2B2C2D1，能夠提高真菌數(shù)量的組合是A1B1C1D3。其中A1出現(xiàn)了3回，A2出現(xiàn)了2回，A3出現(xiàn)了1回，B1出現(xiàn)了2回，B2出現(xiàn)了4回，C1出現(xiàn)了3回，C2出現(xiàn)了2回，C3出現(xiàn)了1回，D1出現(xiàn)了2回，D2出現(xiàn)了2回，D3出現(xiàn)了2回。因此，本試驗(yàn)的主要因素是B，最好的水平是B2。也就是說(shuō)使用聯(lián)合固氮菌對(duì)退化土壤各個(gè)微生物指標(biāo)的影響最大，其中施用2.5mL·kg-1的聯(lián)合固氮菌的處理對(duì)修復(fù)退化土壤的微生物區(qū)系效果最好。

表7 正交設(shè)計(jì)直觀分析Tab.7 Analysis of orthogonal design and intuitive

3 結(jié)論與討論

對(duì)于因水土流失而造成養(yǎng)分流失、沙化和微生物活性下降的退化土壤，種植紫花苜蓿和施用根際有益微生物對(duì)退化土壤的微生物數(shù)量的提高是非常迅速的，且最后會(huì)維持一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，不會(huì)因再次加入根際有益微生物而再次增加。但施用的根際有益微生物的種類和數(shù)量不同對(duì)提高微生物數(shù)量的速度和維持退化土壤微生態(tài)平衡的力度是不同的。一般施用的根際有益微生物越多，退化土壤的細(xì)菌總數(shù)也增加得越快。施用30mL聯(lián)合固氮菌菌懸液在第一個(gè)月基本上就使退化土壤的細(xì)菌數(shù)量、固氮菌數(shù)量、硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最高值。而各個(gè)處理的根瘤菌、真菌數(shù)量則很快便達(dá)到穩(wěn)定值，甚至不到一個(gè)月。各個(gè)處理對(duì)退化土壤的放線菌數(shù)量影響不顯著。空白處理的各個(gè)微生物指標(biāo)雖然隨后也達(dá)到了和其他處理相似的水平，但其形成的微生態(tài)系統(tǒng)非常容易被破壞，這從漚熟后退化土壤各個(gè)處理的微生物數(shù)量的變化可以看出。施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)退化土壤固氮菌數(shù)量、根瘤菌數(shù)量、真菌數(shù)量的迅速提高有顯著作用，施用滅過(guò)菌的巨大芽孢桿菌菌懸液對(duì)退化土壤的硅酸鹽細(xì)菌、放線菌數(shù)量的提高有顯著作用。施用15mL硅酸鹽細(xì)菌菌懸液可以在第一個(gè)月就迅速提高退化土壤的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量。施用硅酸鹽細(xì)菌對(duì)其他微生物指標(biāo)的作用多體現(xiàn)在種植紫花苜蓿兩個(gè)月后，一般施用了硅酸鹽細(xì)菌的都比空白處理好。漚熟后空白處理的微生物指標(biāo)多變低較多。施入纖維素分解菌對(duì)退化土壤的微生物生態(tài)的平衡沒(méi)有嚴(yán)重的破壞作用。

對(duì)土樣中各個(gè)微生物指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系分析表明，土壤中固氮菌的數(shù)量越多，則細(xì)菌總數(shù)越多，即細(xì)菌總數(shù)與固氮菌數(shù)量成顯著相關(guān)關(guān)系，也就是說(shuō)，促進(jìn)土壤固氮菌數(shù)量的提高有利于土壤中細(xì)菌總數(shù)的提高。退化土壤中根瘤菌數(shù)量與固氮菌數(shù)量也有顯著相關(guān)的關(guān)系，這與兩者的生長(zhǎng)基質(zhì)相似有關(guān)。真菌和細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量和根瘤菌數(shù)量有一定的相關(guān)，但不顯著。對(duì)本試驗(yàn)的正交設(shè)計(jì)的直觀分析表明，在研究中，施用聯(lián)合固氮菌對(duì)修復(fù)退化土樣有著更重要的作用。

［1］龍偉文，王平，馮新梅，胡正嘉，李阜棣.PGPR與AMF相互關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11(2):311-314.

［2］MAREN E.VEATCH，StTEVEN E SMITH，GEORGE VANDEMARK.Shoot Biomass Production among Accessions of Medicago truncatula Exposed to NaCl［J］.Crop Science，Madison:2004，44 (3):1008-1014.

［3］康俊梅，楊青川，樊奮成.RAPD技術(shù)分析不同抗旱性苜蓿品種DNA的多態(tài)性［J］.生物技術(shù)，2005，15(6):37-41.

［4］張琴，龍娟，張磊，等.不同pH值下接種根瘤菌對(duì)紫花苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(5):59-62.

［5］李春明，張磊.根際聯(lián)合固氮菌對(duì)玉米小麥及紅薯的增產(chǎn)效應(yīng)［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(6):506-509.

［6］張超，張磊.真菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基中剛果紅轉(zhuǎn)移機(jī)理研究［J］.微生物通報(bào)，2006，33(6):12-16.

［7］高振生，馬其東，牛志強(qiáng)，洪紱曾.沿海灘涂地區(qū)苜蓿根瘤菌接種方法和效果的研究［J］.草地學(xué)報(bào)，1996，4(4):288-292.