王云云，高 宇，肖 宇，孫 力，徐浩然，聶 迪，張 興，宋淑敏

(黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

大蒜(Allium sativum L.)栽培歷史悠久，是一種藥、菜兼用的世界性蔬菜。大蒜主要靠鱗莖進行無性繁殖。大蒜在長期無性繁殖過程中，易感染多種病毒，造成種性退化。利用組織培養(yǎng)技術進行大蒜脫毒種苗繁育，不僅能脫除病毒，還可以提高大蒜繁殖效率，改進繁殖方法，提高鱗莖產(chǎn)量和品質(zhì)。利用組織培養(yǎng)技術脫除大蒜病毒有兩種途徑:器官發(fā)生途徑和體細胞胚胎發(fā)生途徑［1］。其中器官發(fā)生途徑已有大量研究，目前已建立了以莖尖、根尖［2］、真葉、貯藏葉、莖盤切塊、花序軸頂端分生組織［3］、花藥和花原始體［4］等為外植體的多種大蒜組織培養(yǎng)再生體系。莖尖分生組織研究最多，從培養(yǎng)基的篩選到移栽馴化以及工廠化生產(chǎn)具有研究，但其增殖系數(shù)一般在3～5［5，6］，并且試驗操作要求較高，培養(yǎng)難度大，需要較多的人力物力，使得其規(guī)?；a(chǎn)受到限制。繼而更多的研究轉向提高增殖率和保障脫毒率的研究中。熊正琴［7］，以花序軸為外植體，采用直接成苗途徑，研究了花序軸培養(yǎng)條件，結果表明，取未熟花莖的花序軸為外植體，其繁殖系數(shù)可高達76;王洪?。?］取生殖期大蒜花梗，通過愈傷組織間接誘導叢生芽獲得大量的再生植株。唐巧玲［9］以國內(nèi)4個大蒜栽培品種為材料，建立了以根為外植體的再生體系。馬雯［10］，以莖尖分生組織培養(yǎng)結合熱處理的方法脫除大蒜病毒，建立大蒜莖尖脫毒培養(yǎng)體系，并以新鮮的或低溫貯藏的蒜薹為外植體，研究了貯藏時間和植物生長激素對花苞培養(yǎng)誘導形成氣生鱗莖的影響，以及氣生鱗莖大小、處理溫度和植物激素配比對氣生鱗莖的萌發(fā)率的影響，建立了莖尖脫毒培養(yǎng)體系和大蒜花苞誘導形成氣生鱗莖的技術條件。曾建軍［11］以大蒜莖盤為外植體進行脫毒快繁，獲得芽誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。張素芝［12］研究了植物激素對大蒜莖盤組織培養(yǎng)指出，高濃度生長素有利于大蒜愈傷組織誘導，但不利于分化，通過莖盤培養(yǎng)的增殖系數(shù)可達到7.5，但繼代次數(shù)的增加嚴重影響了染色體變異率。龍玉娟［13］以大蒜品種‘三月黃’花序軸為外植體進行離體培養(yǎng)，對其器官發(fā)生過程進行了形態(tài)學和解剖學觀察;以‘二水早蒜’、‘徐州白蒜’和‘金鄉(xiāng)大蒜’4個品種大蒜的胚性與非胚性愈傷組織為材料，進行了形態(tài)學及解剖學的觀察，并通過器官直接發(fā)生、愈傷組織和體胚發(fā)生3種再生方式，對4個品種大蒜的再生試管苗及試管鱗莖形成過程及植株生長發(fā)育進行了比較。結果表明，大蒜花序軸離體培養(yǎng)不經(jīng)過愈傷組織，通過器官直接發(fā)生途徑形成不定芽，其不定芽起源于大蒜花序軸維管組織韌皮部一側周圍的皮層薄壁細胞，屬于外起源，不定芽通過壯苗、生根培養(yǎng)可正常生根形成植株，如果轉接培養(yǎng)周期超過21d，鱗莖形成率可達90.56%。大蒜胚性愈傷組織表面光滑且有易分散的橢圓形顆粒，擁有多個連續(xù)分生中心;而非胚性愈傷組織表面有瘤狀突起，沒有多個連續(xù)的分生中心。愈傷組織途徑和體胚途徑的增殖系數(shù)較高，達9.27～20.11;器官直接發(fā)生途徑的試管鱗莖形成率較高，為20.11% ～43.55%;愈傷組織途徑和體胚途徑的試管鱗莖形成率在15%以下。張恩讓［14］在大蒜芽直接再生途徑和愈傷組織途徑再生植株的過程中體細胞無性系變異的發(fā)生規(guī)律的研究中指出，大蒜體細胞無性系變異主要發(fā)生在愈傷組織形成階段和愈傷組織繼代增殖過程中。供試的5個品種莖尖生長點直接生芽培養(yǎng)時，由于沒有經(jīng)歷愈傷組織階段，所以，在再生植株中，幾乎沒有檢測到染色體變異發(fā)生;而經(jīng)歷愈傷組織誘導培養(yǎng)，再分化形成的再生植株均出現(xiàn)了高頻率的染色體變異，且染色體變異頻率隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，說明變異是在愈傷組織培養(yǎng)過程中依次出現(xiàn)并累加的。孟新亞［15］以中牟5號大蒜根尖為外植體，篩選出愈傷誘導培養(yǎng)基和胚性愈傷誘導培養(yǎng)基，獲得胚性愈傷懸浮系的培養(yǎng)條件。梁艷［16］對不同蔗糖濃度對阿城紫皮大蒜試管微鱗莖的形成和膨大的影響進行研究，結果表明，隨著蔗糖濃度的提高，大蒜試管微鱗莖形成被促進，而鱗莖發(fā)生數(shù)呈下降趨勢。欒非時在1995年［17］，以黑龍江省阿城脫毒紫皮種蒜為試材，應用植物組織培養(yǎng)技術，探討利用花原始體進行培養(yǎng)增殖的技術，其繁殖系數(shù)為3.1848，并且經(jīng)幼苗根尖染色體壓片、鏡檢，未發(fā)現(xiàn)有任何染色體變異。

綜上所述，通過莖尖分生組織直接誘導出芽的途徑，成苗速度較快，變異率低，有利于保持品種種性，脫毒率較高，但增殖系數(shù)小，操作要求高，不利于工廠化生產(chǎn);而通過誘導愈傷組織再生途徑，增殖系數(shù)高，但染色體變異率大，不利于保持品種種性;而體細胞胚再生途徑，增殖率高，但其鱗莖形成率低。因此，仍需探尋一種高增殖率，高脫毒率，低變異率，短繁殖周期的高效大蒜脫毒快繁的技術體系。

M.Ayabe［18，19］在利用大蒜莖盤脫毒的研究中指出，在莖盤培養(yǎng)過程中，莖盤表面會形成圓形突起，組織觀察發(fā)現(xiàn)，這些圓形突起在內(nèi)部細胞組織和結構形成過程與大蒜蒜瓣芽尖形成過程相似，同時，在不定芽幼芽階段(＜1mm)是脫毒的。因此，本項目以莖盤誘導出的不定芽為外植體進行快繁，以我國北方主栽大蒜品種為試驗材料，解決我國北方省份大蒜快繁中增殖系數(shù)低，操作難度大等影響大蒜快繁產(chǎn)業(yè)化的技術瓶頸，為大蒜脫毒快繁的規(guī)模化生產(chǎn)提供技術基礎。

1 試驗材料

阿城大蒜，從哈爾濱市阿城區(qū)購買的當年新蒜。

2 試驗內(nèi)容與方法

2.1 試驗材料的處理

將阿城大蒜剝掉蒜皮，將蒜瓣清洗干凈，除去多余的鱗莖，留有莖盤和5mm厚的鱗莖，用75%的酒精滅菌5min。在無菌條件下，去除多余的鱗莖，將莖盤切割成1mm厚的4個小塊，分別接種到誘導培養(yǎng)基中。

2.2 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為 LS 培養(yǎng)基(Linsmaier E，Skoog F)［20］或MS培養(yǎng)基，含蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH 值5.8，培養(yǎng)于光照12h/d，光照度1 400lx，溫度25±2℃。

2.3 莖盤不定芽誘導培養(yǎng)

莖盤的繁殖系數(shù)的計算均以每個蒜瓣的莖盤為單位。以LS為基本培養(yǎng)基，探討不同NAA和6－BA濃度對莖盤不定芽誘導的影響，試驗設計二因素三水平全部組合試驗，NAA 和6 －BA 的濃度梯度為 0，0.1，0.5，每瓶培養(yǎng)基接種3塊莖盤，每個處理10瓶，培養(yǎng)15d后，統(tǒng)計不定芽數(shù)。

2.4 繼代培養(yǎng)

取莖盤上長出的不定芽(1mm左右)，基部要帶一部分莖盤，接種到繼代培養(yǎng)基上。

基本培養(yǎng)基種類、6－BA和NAA組合對不定芽生長和增殖的影響試驗:在MS和LS培養(yǎng)基中，保持6－BA和NAA 的濃度比例為 10∶1，設置 0.5∶0.05，1.0∶0.1，2.0∶0.2，3.0∶0.3，4 個水平。保持NAA 濃度為0.1 mg/L ，設置6 －BA 與 NAA 的濃度比為 2∶1，5∶1，10∶1 ，20∶1 ，30∶1 等 5 個水平，共28個處理，重復2次。每個處理30個不定芽，培養(yǎng)15d后測量苗高和統(tǒng)計苗數(shù)，計算增殖系數(shù)。

2.5 生根和試管微鱗莖培養(yǎng)

以莖盤不定芽為外植體的試管苗易于生根，因此，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，探討不同NAA、IAA和溫度對試管微鱗莖形成的影響，試驗采用L9(33)正交試驗設計，各因素水平設置見表1，共9個處理，重復3次。培養(yǎng)15d后統(tǒng)計生根率和鱗莖形成率。

表1 因素和水平Tab.1 Factors and levels

3 結果與討論

3.1 不同激素配比對莖盤不定芽誘導的影響

接種7d后，莖盤表呈現(xiàn)出疣狀突起，培養(yǎng)15d逐漸可觀察到生長出來的不定芽(圖1)，通過不同生長素和細胞分裂素的配比試驗可以看出(圖2)，高濃度的NAA和6－BA對不定芽的產(chǎn)生都有一定的抑制作用，通過對不定芽數(shù)的統(tǒng)計，LS+NAA0.0+6－BA0.1培養(yǎng)基的不定芽誘導率最高，平均每塊莖盤可產(chǎn)生5.7個不定芽(圖2)，按每個莖盤分成4個小塊計算，增殖系數(shù)為22.8。

圖1 莖盤不定芽誘導Fig.1 Development of vitro shoots from a stem disc

雙因素方差分析表明6－BA濃度的增加對不定芽誘導率的影響不顯著(F＜Fcrit，P －value＞0.05)，而 NAA 濃度的增加則明顯抑制不定芽的產(chǎn)生(F＞Fcrit，P－value＜0.05)，這與 M.Ayabe［18］等的研究一致。

圖2 激素對莖盤不定芽誘導的影響Fig.2 Effect of phytohormone on development of in vitro shoots from a stem disc

3.2 不同激素水平對不定芽生長的影響

由圖3可以看出，對不定芽生長和增殖來看，在不同的激素濃度和配比下，均以LS培養(yǎng)基最宜，經(jīng)過方差分析表明，在6－BA和NAA的濃度比值不變的情況下，濃度的變化對不定芽的生長和增殖沒有顯著影響(表3，F(xiàn)＜Fcrit，P－value＞0.05)，而不同培養(yǎng)基類型對不定芽的生長和分化有顯著影響(表3，F(xiàn)＞Fcrit，P －value＜0.05)。從6－BA和NAA不同濃度配比試驗中可以看出(圖3c，d)，隨著6－BA和NAA的濃度比值增大，不定芽的生長和分化得到不同程度的促進，增殖系數(shù)最高達到了4.56，但在試驗中觀察以及后續(xù)的生根馴化中來看，增殖系數(shù)大于4和株高超過6cm的幼苗，往往生長細弱，不利于后續(xù)的生根和微鱗莖的形成(圖4)，同時還需要進行壯苗才能達到較高的馴化成活率，這樣雖然提高了增殖系數(shù)，但是延長了快繁時間，降低了快繁效率。因而，綜合考慮從不定芽的生長和增殖效果以及繁殖效率來看，LS培養(yǎng)基+6－BA2.0+NAA0.2組合最適合不定芽的繼代培養(yǎng)。

表2 激素水平對不定芽誘導的方差分析表Tab.2 Variance analysis of effect of phytohormone on development of shoots from a stem disc

3.3 不同溫度和激素水平對大蒜微鱗莖形成和生根的影響

圖3 不同培養(yǎng)基和6－BA、NAA組合對不定芽生長和增殖的影響Fig.3 Effects of medium and combinations of 6 － BA and NAA on garlic plantlet growth and proliferation

表3 不同培養(yǎng)基類型和激素含量對不定芽的影響的方差分析Tab.3 Variance analysis of effects of medium and phytohormone on garlic plantlet growth

圖4 不定芽的繼代培養(yǎng)Fig.4 Successive transfer culture of garlic plantlet

經(jīng)過不同培養(yǎng)溫度和激素水平的處理，結果通過表4可以看出，相對于不添加激素的1/2MS培養(yǎng)基，添加一定量的激素均有促進大蒜生根和微鱗莖形成的作用。由處理3、5、6、7和9可以看出，較高濃度的IAA可以促進生根和微鱗莖的形成，而較高濃度的NAA則起不到促進作用，因此，較高濃度的IAA和較低濃度的NAA組合利于生根和微鱗莖的形成。從大蒜微鱗莖的形成和生根效果來看，不同處理溫度對形成微鱗莖的影響要大于對生根的影響。在較高溫度下，有較高的生根率卻有較低的鱗莖形成率，隨著溫度的降低，生根率顯著下降，而鱗莖形成率顯著增高。培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，溫度較高時25℃ ～27℃，根更傾向于伸長生長，而溫度較低時10℃ ～15℃，幼苗基部可形成大量叢生、短而壯的根，根的伸長生長受到抑制，轉向形成微鱗莖(圖5)，而當溫度小于10℃生根率有所下降，從而影響微鱗莖的形成，因此，綜合考慮溫度和激素的相互作用，以培養(yǎng)溫度10℃ ～15℃，NAA0.1+IAA0.5 處理為生根和誘導微鱗莖形成的最佳培養(yǎng)基。

4 結論

大蒜莖盤分生能力強，可誘導產(chǎn)生大量不定芽，是大蒜快繁的絕佳外植體。通過試驗研究莖盤不定芽誘導最適培養(yǎng)基為LS+6BA0.1，不定芽繼代的最佳培養(yǎng)基為LS培養(yǎng)基+6－BA2.0+NAA0.2，不定芽繼代過程中，要控制增殖系數(shù)和株高，將繼代和壯苗結合成在一起完成，這樣不但提高了成活率還能大大縮短快繁時間。生根和誘導微鱗莖的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1+IAA0.5，適當?shù)牡蜏赜欣谖Ⅶ[莖的形成，但溫度過低會影響根的生長，試驗表明10℃ ～15℃的培養(yǎng)溫度，有利于試管微鱗莖的形成和生根。本研究綜合考慮快增殖系數(shù)、馴化成活率和快繁周期等快繁過程中的關鍵因素，從控制分化和徒長的角度篩選最佳組合的培養(yǎng)基，有利于大蒜莖盤不定芽快繁技術的推廣應用。

表4 不同激素水平處理對鱗莖形成和生根的影響Tab.4 Effect of phytohormone on rooting and bulb form

圖5 不同培養(yǎng)溫度處理下大蒜幼苗生根和微鱗莖的形成Fig.5 The rooting and bulb forming of garlic plantlet in different culture temperature

［1］孫曉波.大蒜微繁的一種新技術體系的構建［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學，2002.

［2］ALEJANDRINA.Efficient plant regeneration of garlic(Allium Sativum L.)by root － tip culture［J］.In Vitro Cell.Dev.Biol，2000，(36):416 －419.

［3］MA Y，HONG －LONG WG，CUN －JIN Z，et al.High rate of virus－ free plantlet regeneration via garlic scape － tip culture［J］.Plant Cell Rep，1994，(14):65 －68.

［4］EBI M，KASAI N，MASUDA K.Small inflorescence bulbils are best for micropropagation and virus elimination in garlic［J］.Hort Science，2000，(35):735 －737.

［5］胡小京.大蒜組織培養(yǎng)快繁技術的研究［J］.長江蔬菜(學術版)，2011，(20):13 －15.

［6］趙俊麗.大蒜莖尖培養(yǎng)研究初報［J］.河北農(nóng)業(yè)科學，2003，7(4):67－68.

［7］熊正琴.大蒜花序軸離體培養(yǎng)的研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2000，23(3):25 －28.

［8］王洪隆.大蒜花梗組織培養(yǎng)再生植株［J］.華北農(nóng)學報，1992，(3):12－15.

［9］唐巧玲.以根為外植體建立大蒜的組織培養(yǎng)體系［J］.生物技術進展，2011，(2):140 －145.

［10］馬雯.大蒜莖尖脫毒體系的建立與病毒電鏡檢測分析［D］.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學，2011.

［11］曾建軍.江西省名優(yōu)地方品種螺田大蒜脫毒快繁研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(13):5870 －5871.

［12］張素芝.植物激素對大蒜莖盤組織培養(yǎng)的影響［J］.西南農(nóng)業(yè)大學學報，2006，5(28):805 －808.

［13］龍玉娟.大蒜花序軸離體培養(yǎng)器官發(fā)生途徑的解剖學研究［J］.西北植物學報，2008，3(1):56 －59.

［14］張恩讓.大蒜體細胞無性系的染色體變異研究［J］.西北農(nóng)林科技大學學報，2004，(9):58 －60.

［15］孟新亞.大蒜胚性細胞懸浮系的建立［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2002，(6):102 －105.

［16］梁艷.蔗糖濃度對阿城紫皮大蒜試管微鱗莖形成和膨大的影響［J］.中國農(nóng)學通報，2005，4(21):185－187.

［17］欒非時.脫毒大蒜花原始體培養(yǎng)增殖技術的研究［J］.中國蔬菜，1995，(3):4 －6.

［18］M.AYABE.A novel and efficient tissue culture method－“stem－disc dome culture”－for producing virus－free garlic(Allium sativum L.)［J］.Plant Cell Rep，2001，(20):503 －507.

［19］M.AYABE.Establishment of a novel tissue culture method，stem－disc culture and its practical application to micropropagation of garlic(Allium sativum L.)［J］.Plant Cell Reports，1998，(17):773－779.

［20］LINSMAIER E，SKOOG F.Organic growth factor requirements for tobacco tissue cultures［J］.Physiol Plant，1965，(18):100 －127.