羅永聰，馬 嘯，張新全

(四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系，四川 雅安 625014)

一年生黑麥草(Loliummultiflorum)又名意大利黑麥草、多花黑麥草，是具世界栽培意義的禾本科牧草，具有產(chǎn)量高和品質(zhì)好的優(yōu)點，被廣泛用于建植人工草地、割草地和放牧地[1]。一年生黑麥草栽培品種多為人工選育的同源四倍體(2n=4x=28)，加之以異花授粉的繁育特性，造成其種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)復雜，品種遺傳基礎表現(xiàn)出相當大的異質(zhì)性[2]，即品種中的個體間存在較大的遺傳變異。在分析異質(zhì)雜合植物群體間和群體內(nèi)變異時，一般對品種和生態(tài)型群體進行個體取樣分析，而最佳的群體取樣數(shù)量主要取決于最小的共享等位基因或基因型的頻率。例如,要分析不小于10%的等位基因頻率，群體取樣量為40株左右，而分析不小于5%的等位基因頻率，群體取樣量為100株左右[3]。為了分析更多的基因型，混合單株策略成為一種常見的方法，它在分析掃描基因庫種質(zhì)資源的遺傳多樣性或進行品種鑒定及種子批純度鑒定時發(fā)揮了重要作用。利用RAPD標記分析一些常見異交牧草和草坪草品種群體的最佳混合樣本量，苜蓿(Medicagosativa)為7株[4]，紅三葉(Trifoliumpratense)和海濱雀稗(Paspalumvaginatum)各為20株[5-6]，而多年生黑麥草(L.perenne)為30株[7]，對白三葉(T.repens)品種群體的AFLP分析發(fā)現(xiàn)，隨機選取品種內(nèi)的20個單株混合提取的DNA樣本可有效地分析品種間的遺傳關系,并且同一品種群體內(nèi)單株具有的90%的條帶會在混合樣本中重現(xiàn)，丟失的條帶都是一些稀有條帶[8]。SSR(Simple Sequence Repeats)又名微衛(wèi)星(Microsatellite)，是一類具有高度多態(tài)性的分子標記,目前已廣泛應用于植物遺傳育種研究[9-11]。在用SSR進行遺傳多樣性或品種指紋鑒定分析時首先考慮的是樣本數(shù)量問題，采集的樣本數(shù)量應該能代表某一群體的總體遺傳多樣性水平[12]。目前國內(nèi)尚未見利用SSR標記分析一年生黑麥草遺傳多樣性的取樣策略的研究報道，本研究以兩個一年生黑麥草國家審定品種為材料，通過對不同混合單株梯度下樣本間遺傳多樣性的差異分析，探討進行一年生黑麥草遺傳多樣性分析時的科學取樣策略。

1 材料與方法

1.1試驗材料 以“長江2號”和“特高”兩個一年生黑麥草品種為材料，分別從兩個群體中提取50個單株DNA，同時提取5、10、15、20、25和30個單株葉片等質(zhì)量混合后樣本的DNA，混合樣本中的單株取自單株樣本。其中，單株DNA樣品(共50個樣本)用A表示，5、10和15株葉片混合提取的DNA(均為10個混合樣本)分別用B、C和D表示，20株葉片混合提取的DNA(共8個混合樣本)用E表示，25株葉片混合提取的DNA(共6個混合樣本)用F表示，30株葉片混合提取的DNA(共5個混合樣本)用G表示，每個品種共獲得99個DNA樣本。試驗所用的3對一年生黑麥草SSR引物信息[13]見表1，引物均由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取 用CTAB法提取基因組DNA，通過采用0.8%瓊脂糖電泳和GE微量紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度，合格的DNA樣品于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將DNA樣品取出一部分稀釋至10 ng·μL-1，放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2擴增反應和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 PCR擴增反應總體積為20 μL，其中PCR-Mix 10 μL，模板DNA 2 μL(10 ng·μL-1)，正、反向引物各0.8 μL(10 pmol·μL-1)，Taq酶0.4 μL(2.5 U·μL-1)，ddH2O補足體積。96孔板用硅膠蓋覆蓋密封，PCR擴增在MJ 200 PCR 儀上進行。PCR反應程序采用Touchdown模式，即94 ℃預變性5 min； 10個降落PCR循環(huán)：94 ℃變性30 s，退火溫度由65 ℃開始，每個循環(huán)降低0.5 ℃，直至60 ℃，退火45 s，72 ℃延伸1 min；30個循環(huán)：退火溫度為60 ℃，變性和延伸溫度同上；72 ℃延伸7 min，10 ℃保存。擴增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進行檢測。每樣品上樣6 μL，以50 bp DNA Ladder為分子量標準，200 V恒壓下預電泳30 min，后在400 V恒壓下電泳1.5 h，再用0.1%的AgNO3進行銀染和在NaOH溶液中顯色，凝膠用數(shù)碼相機照相保存[14]。

表1 3對SSR引物信息Table 1 The information of 3 SSR primer pairs

1.2.3數(shù)據(jù)處理 參照每對引物的期望擴增片段大小，對每對SSR引物(即每個標記位點)的擴增產(chǎn)物，按照擴增帶的分子量從大到小編號和讀取，僅統(tǒng)計期望擴增片段±50 bp范圍內(nèi)的片段(此范圍外的片段極有可能是非特異產(chǎn)物)。在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，建立原始數(shù)據(jù)庫。每個SSR位點的多態(tài)性信息量(Polymorphism Information Content,PIC)按Smith等[15]的方法計算，即PIC=1-∑fi2,其中fi為i位點的基因頻率，基因頻率fi=某一等位基因數(shù)/總等位基因數(shù)；每個SSR位點的平均等位基因數(shù)=總等位基因數(shù)/N(N為混合樣本單株數(shù))。采用完全隨機設計的單因素方差分析，對不同取樣量獲得的平均等位基因進行多重比較(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1多態(tài)性信息量指數(shù)比較 針對不同混合樣本的電泳圖進行人工計帶，統(tǒng)計等位基因(等位片段)的種類和頻率(圖1)，進而計算PIC值。對不同取樣水平下兩個一年生黑麥草品種PIC分7個取樣梯度進行統(tǒng)計分析表明，隨著單株取樣數(shù)目的增加，PIC指數(shù)逐步趨于穩(wěn)定?！伴L江2號”和“特高”PIC的變幅分別為0.605～0.875和0.643～0.856(表2)。經(jīng)LSD法檢驗，取樣梯度間PIC差異不顯著(P>0.05)，這與異花授粉植物群體內(nèi)個體有較高差異有關。但當混合樣本為20株時，PIC達到最高值，表明采用此樣本能較好地反映出供試品種群體在3個SSR座位上的多態(tài)性。

2.2等位基因數(shù)量差異分析 從SSR電泳圖譜總體來看,一年生黑麥草兩個品種依所取單株數(shù)量的多少，在3個SSR座位上擴增出的平均等位基因數(shù)量上變化顯著。兩個品種均以單株DNA樣本獲得的平均等位基因數(shù)最小，以20、25和30株混合樣本擴增獲得的平均等位基因數(shù)最大；“長江2號”20、25、30株混合樣本獲得的平均等位基因數(shù)差異不顯著(P>0.05)；但“特高”的20株和30株混合樣本獲得的平均等基因位數(shù)差異顯著(P<0.05)，且25和30株混合樣本的平均等位基因數(shù)較20株有所下降，這可能與PCR擴增過程中不同基因型DNA的量會影響其擴增產(chǎn)物的數(shù)量有關。平均等位基因數(shù)的變化趨勢表明，當各取樣水平樣本數(shù)一致時，等位基因數(shù)隨樣品內(nèi)混合單株數(shù)目的增加而增加，當取樣株數(shù)增至20株及以上時，取樣梯度間無顯著差異，說明20株的樣本量即能代表該品種的整體遺傳狀況(表3)。

圖1 引物LMgSSR 02-07F對“特高”不同DNA混合樣本的擴增結(jié)果Fig.1 PCR product landing pattern of 6 kinds of DNA samples from leaf mixture of Tetragold amplified by LMgSSR 02-07F

2.3單個SSR座位上等位基因種類和缺失等位基因頻率的比較 單株樣本獲得的等位基因種類最多，以其為參照標準比較混合樣本，等位基因種類隨取樣株數(shù)增加而增加，并在取樣株數(shù)≥20株后趨于穩(wěn)定，這表明20、25和30株混合DNA樣本對等位基因擴增的重演性更好?；旌先~片DNA樣本均未能檢出稀有(基因頻率≤10%)等位基因，而對于高頻率(基因頻率>10%)等位基因的漏檢數(shù)目隨混合取樣株數(shù)的增大而降低(表4)。但若用引物LMgSSR02-07F擴增“特高”25和30株混合DNA樣本時，未能檢測到的等位基因有7個，其中包括頻率分別為0.52、0.34、0.30和0.24的4個高頻等位基因(表5)。5、10和15株混合DNA樣本擴增獲得的等位基因種類最少，未能檢測到的等位基因數(shù)目最多，且某些較高頻率的等位基因也被漏檢，因此不可取。綜上，不考慮稀有等位基因(基因頻率≤10%)的漏檢，采用20株混合單株樣本能夠最大限度檢出較高頻率(基因頻率>10%)的等位基因，可以代表整個群體(表4、表5)。

表3 不同混合單株梯度下平均等位基因數(shù)差異比較Table 3 The average allele of three SSR loc in different bulked plant samples

表4 “長江2號”一年生黑麥草單個SSR座位上等位基因種類和缺失等位基因頻率的比較Table 4 The varieties of alleles and the frequency of the absent allele of per SSR loc in Lolium multiflorum cv.Changjiang No.2

表5 “特高”一年生黑麥草單個SSR座位上等位基因種類和缺失等位基因頻率的比較Table 5 The varieties of alleles and the frequency of the absent allele of per SSR loc in Lolium multiflorum cv.Tetragold

3 討論與結(jié)論

基于分子標記的單株混合法已經(jīng)成功運用于一些異花授粉的牧草或草坪草上[16-18]。雖然超過5個單株的混合樣本具有丟失某些個體具有的條帶(稀有或低頻率基因片段)的風險[19]，但是單株數(shù)量較大的混合樣本能在1次試驗中檢測到特定群體的大部分遺傳信息，這對于比較異質(zhì)群體的遺傳關系非常有用。對于品種鑒定或構(gòu)建品種指紋時，需要獲得的重要信息是品種群體的高頻率特異等位基因，因為低頻片段不能代表整個品種群體內(nèi)的大部分單株的遺傳狀況[20]。另外，有研究[18,21]表明等位基因數(shù)隨混合單株數(shù)的增加而增加后趨于穩(wěn)定，本試驗用3對引物對“長江2號”的擴增結(jié)果也吻合了這一點。但“特高”采用25、30株混合單株樣本時，平均等位基因數(shù)較20株卻略有下降，且對一些高頻率等位基因的漏檢也有所增加。利用SSR標記研究玉米(Zeamays)群體遺傳變異時發(fā)現(xiàn)，混合樣本中的單株數(shù)目越多,電泳效果則越不好，也就越不容易區(qū)分帶型[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，25和30株葉片混合的DNA樣本擴增效果不及20株，這可能與PCR擴增過程中不同基因型DNA的量會影響其擴增產(chǎn)物的數(shù)量有關。在混合單株樣本中，每個單株(基因型)的DNA量顯著少于常規(guī)提取的單株DNA，對某些具有低頻等位基因的基因型而言，大部分引物將被擴增高頻片段的位點結(jié)合，導致低頻片段的產(chǎn)生效率很低且信號微弱，很難被常規(guī)的凝膠染色檢測出來。同時不同單株DNA間還可能相互競爭同一引物的結(jié)合位點[22]，因此會出現(xiàn)25、30株或更多單株葉片混合的樣本擴增效果不及20株的結(jié)果。

綜合PIC、等位基因數(shù)量、等位基因種類及對高頻等位基因的漏檢情況等的綜合分析，本試驗得出：利用SSR標記進行一年生黑麥草遺傳多樣性分析時的最佳樣本容量為20株，這對于分析一年生黑麥草品種鑒定和品種間遺傳關系分析具有重要的方法學指導意義。合理的取樣策略更是遺傳育種和保護生物遺傳資源多樣性的基礎，以上研究結(jié)果可為一年生黑麥草種質(zhì)資源評價和分子育種提供科學依據(jù)。

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