吳黃銘，李 江，王光輝，陳惠萍，3

(1．海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南 海口 570228； 2．復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究所，上海200433； 3．海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南 ?？?570228)

細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)是指生物體生長發(fā)育到特定階段，由細(xì)胞內(nèi)既定的程序引發(fā)的一種由自身基因控制的死亡過程。它是調(diào)節(jié)細(xì)胞群體相對平衡的一種重要方式，與細(xì)胞有絲分裂方式截然相反。許多證據(jù)表明，植物PCD是植物生長發(fā)育的特定時期，特定部位的細(xì)胞呈現(xiàn)出特征形態(tài)和生化改變的細(xì)胞死亡形式，這些改變是一系列基因被激活而引起的級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，這種形式的細(xì)胞死亡有利于自身結(jié)構(gòu)形成和組織分化[1-4]。因此，PCD是植物體中普遍存在的一種重要生命現(xiàn)象，在發(fā)育的各個特定階段均有自然的細(xì)胞死亡過程發(fā)生。

禾谷類種子糊粉層是位于胚乳與胚之間的由一至多層的薄壁細(xì)胞構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞含有大量積累蛋白質(zhì)的糊粉粒，因而被稱為糊粉層。糊粉層主要的生理功能就是將合成的水解酶分泌到淀粉胚乳，然后降解貯藏在淀粉胚乳中的物質(zhì)，為胚的生長發(fā)育提供營養(yǎng)，而當(dāng)胚萌發(fā)后，這些糊粉層細(xì)胞便很快死亡。禾谷類種子萌發(fā)過程中糊粉層細(xì)胞的死亡屬于PCD[5-6]，可見PCD是禾谷類種子萌發(fā)過程必不可少的一個環(huán)節(jié)。如果禾谷類種子萌發(fā)過程中糊粉層不發(fā)生PCD，種子胚就會因得不到養(yǎng)分供應(yīng)而停止活動，萌發(fā)過程隨之終止。近年發(fā)表的有關(guān)植物PCD的綜述很多[7-8]，但有關(guān)禾谷類種子萌發(fā)過程中的PCD的綜述卻極少。

1 禾谷類種子糊粉層細(xì)胞程序性死亡的特征

禾谷類種子發(fā)育過程胚乳分化為淀粉性胚乳和糊粉層。其中，糊粉層是胚乳表層細(xì)胞分裂停止后轉(zhuǎn)化來的，分布在胚乳的外圍。胚乳表皮細(xì)胞之所以可以轉(zhuǎn)化成糊粉層細(xì)胞，可能與它積累的大量礦物質(zhì)、脂類和蛋白質(zhì)等“灌漿廢物”有關(guān)。當(dāng)籽實成熟時，所有淀粉性胚乳細(xì)胞死亡，只有糊粉層細(xì)胞還存活。隨著糊粉層細(xì)胞逐漸成熟，胞內(nèi)的細(xì)胞器越來越多，其中占最大比例的細(xì)胞器是蛋白貯藏液泡(Protein Storage Vacuoles，PSVs)。在種子萌發(fā)過程中，很多小的PSVs逐漸合并成大的中央液泡，當(dāng)大液泡破裂時，細(xì)胞隨即出現(xiàn)皺縮并死亡。因此，糊粉層細(xì)胞中PSVs的數(shù)量和大小一直被當(dāng)成PCD的半定量標(biāo)記[1-2]。種子萌發(fā)過程中，胚釋放出赤霉素(Gibberellin，GA)，糊粉層細(xì)胞受到GA的誘導(dǎo)產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和核酸酶等一系列水解酶，從而分解胚乳中貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)，供給胚用于早期生長。當(dāng)糊粉層細(xì)胞釋放出水解酶后，糊粉層從內(nèi)向外，其細(xì)胞內(nèi)的圓球體及糊粉粒開始出現(xiàn)解體，隨后，圓球體和糊粉粒解體出來的部分營養(yǎng)用于胚的生長，其余的互相融合，成為無結(jié)構(gòu)的液滴[9-10]。Fath等[5-6]研究證實，大麥(Hordeumvulgare)糊粉層細(xì)胞在死亡過程中，先發(fā)生液泡化現(xiàn)象；隨后質(zhì)膜完整性喪失，蛋白酶和核酸酶活力增強。在核酸酶的水解作用下，DNA降解，但不形成典型的180～200 bp的DNA條帶，最后細(xì)胞消失，過程有點類似細(xì)胞自溶，具有非典型凋亡PCD的特點。Bethke等[1]也發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞死亡前，大麥糊粉層細(xì)胞高度液泡化，細(xì)胞質(zhì)及相關(guān)細(xì)胞器的體積變小，從而認(rèn)為可以將糊粉層細(xì)胞的液泡化作為糊粉層細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特征之一，以此來反映糊粉層PCD的進程。大麥糊粉層細(xì)胞死亡與液泡化程度有極大的相關(guān)性。在未達(dá)到高度液泡化之前，糊粉層細(xì)胞還是活細(xì)胞；當(dāng)高度液泡化出現(xiàn)不久，糊粉層細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的相關(guān)細(xì)胞器的內(nèi)含物迅速被分解[1],細(xì)胞死亡。

通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，在正常條件下水稻(Oryzasativa)種子糊粉層PCD的進程可以通過糊粉層細(xì)胞的液泡化程度反映出來，而且水稻種子糊粉層細(xì)胞液泡化進程不但具有時間效應(yīng)，還同時具有位置效應(yīng)。用吖啶橙(Acridine Orange，AO)熒光試劑染色發(fā)現(xiàn)，DNA的降解與胚的距離及液泡化程度有關(guān)：離胚越近，液泡化程度越大，DNA降解越快[11]。Wang等[12]在研究大麥糊粉層細(xì)胞死亡時也發(fā)現(xiàn)，DNA片段化存在時空變化的特征，并證實最初發(fā)生PCD的細(xì)胞是在靠近胚的糊粉層里，而且其PCD的發(fā)生遲于糊粉層細(xì)胞α-淀粉酶mRNA的產(chǎn)生。Bethke等[1,13]的研究也證明了萌發(fā)種子糊粉層PCD受到糊粉層細(xì)胞與胚的位置效應(yīng)的調(diào)控，離胚最近的糊粉層細(xì)胞率先發(fā)生PCD，這可能是因為植物激素GA是從胚產(chǎn)生的緣故。

2 激素對禾谷類種子糊粉層細(xì)胞程序性死亡的影響

從種子生物學(xué)角度來看,脫落酸(Abscisic Acid，ABA)分解作用和GA合成作用在種子萌發(fā)中起著重要作用[14-17]。在禾谷類種子糊粉層中，ABA與GA存在拮抗作用，并抑制編碼糊粉層水解酶基因的表達(dá)[18]。GA處理大麥糊粉層原生質(zhì)體后，其PCD與PSVs的液泡化是一致的，而ABA卻阻止此過程發(fā)生[1-2]。Guo和Ho[19 ]觀察大麥糊粉層細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在未加入激素時，糊粉層細(xì)胞中分布著許多小的蛋白貯藏液泡；如果用1 μmol·L-1GA處理48 h，這些小液泡合并成一個大液泡；但如果再加入20 μmol·L-1ABA同樣處理48 h，大液泡的形成則被顯著抑制(圖1)。為了進行定量分析，將包含1～3個大液泡的細(xì)胞界定為液泡化的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GA處理48 h后，液泡化細(xì)胞超過了80%，而ABA則顯著抑制了細(xì)胞液泡化程度[19]。

GA能促進細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，誘導(dǎo)糊粉層細(xì)胞的程序性死亡，而ABA作用正好相反，它能阻斷GA的效應(yīng)，延緩糊粉層細(xì)胞的死亡[7]。ABA維持大麥糊粉層細(xì)胞中高表達(dá)的過氧化氫酶(Cata-lase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate Per-oxidase，APX)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)以清除活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，阻緩PCD；而GA則引起這些抗氧化酶活性快速下降，從而促進細(xì)胞死亡，這一點從試驗中可以證實，GA處理的大麥糊粉層細(xì)胞在培養(yǎng)24～48 h都會死亡[20]。經(jīng)GA處理的大麥糊粉層及其原生質(zhì)體會分泌大量的蛋白酶、核酸酶和α-淀粉酶等水解酶[21]。而GA誘導(dǎo)大麥種子糊粉層α-淀粉酶的轉(zhuǎn)錄會受到ABA的顯著抑制[22]?？箟难?Ascorbic Acid，ASC)通過抑制GA和淀粉酶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)GA的含量和淀粉酶的活性，ABA則通過降低GA合成酶的底物ASC的水平來抑制GA的積累。ABA和NADPH氧化酶抑制劑二聯(lián)苯胺(Diphenyleneiodonium Chloride，DPI)都可以抑制GA合成的關(guān)鍵基因OsGA3ox和OsGA20ox的表達(dá)，并有效地抑制淀粉酶基因表達(dá)和酶活性。ABA和DPI不僅減少種子內(nèi)GA的含量，而且還會通過減少ROS的產(chǎn)生來導(dǎo)致GA合成受抑[23]。用GA處理小麥(Triticumaestivum)糊粉層會誘導(dǎo)正在發(fā)生PCD過程的細(xì)胞產(chǎn)生一種核酸酶，該核酸酶能被Ca2+和Mg2+激活，但被Zn2+抑制，在PCD發(fā)生時積聚在細(xì)胞核周圍。當(dāng)GA合成受抑制時，或在對GA不敏感的突變體中則沒有發(fā)現(xiàn)此核酸酶[24]。為此，Bethke等[1]認(rèn)為，GA是啟動大麥糊粉層PCD的一個信號，而ABA則是該過程的一個調(diào)控子。

圖1 GA和ABA處理后大麥糊粉層細(xì)胞液泡化程度[19] Fig.1 The cell vacuolation of barley aleurone in the treatment of GA and ABA[19]

3 活性氧協(xié)同激素作用于禾谷類種子糊粉層細(xì)胞程序性死亡

近年不少研究表明，ROS在種子萌發(fā)過程中起著關(guān)鍵的作用[25-27]，同樣，在激素調(diào)控糊粉層PCD過程中也扮演著重要的角色[28]。其中過氧化氫(Hydrogen Peroxide，H2O2)是導(dǎo)致糊粉層細(xì)胞程序性死亡的主要ROS[13]。Fath等[20,28]對大麥糊粉層PCD的研究表明，H2O2能夠使經(jīng)GA處理的大麥糊粉層細(xì)胞快速死亡。同時證實了經(jīng)GA處理的糊粉層細(xì)胞，其過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和超氧化物歧化酶的量和活性大幅度下降，使得活性氧積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化性損傷和死亡。此外，H2O2還有助于提高GA處理過的大麥糊粉層細(xì)胞原生質(zhì)體死亡的速率，而抗壞血酸鹽(Ascorbate，AsA)、二巰基蘇糖醇(Reducatant Dithiothreitol，DTT)、丁基羥甲苯(Butylated Hydroxytoluene，BHT)和碘化鈉等抗氧化物質(zhì)則延緩PCD的發(fā)生，這些都證實了活性氧H2O2與糊粉層細(xì)胞死亡有關(guān)聯(lián)[13,29]。經(jīng)GA處理的糊粉層細(xì)胞中，編碼CAT、APX和SOD的mRNA豐度下降；酶蛋白含量和活性顯著下降，最終導(dǎo)致氧化性損傷，細(xì)胞死亡。而經(jīng)ABA處理的糊粉層細(xì)胞中，編碼CAT的mRNA豐度稍有上升，APX和SOD的酶蛋白含量較高，細(xì)胞仍然存活[20,28]。ABA誘導(dǎo)大麥糊粉層細(xì)胞總CAT活性的提高被GA所逆轉(zhuǎn)，用ABA預(yù)先培養(yǎng)糊粉層3 d，然后再將其轉(zhuǎn)移到GA中培養(yǎng)，結(jié)果引起了CAT活性迅速下降及細(xì)胞死亡[20]。內(nèi)源H2O2可能參與GA誘導(dǎo)的小麥糊粉層PCD過程，CAT和APX介導(dǎo)的H2O2分解在該過程中起著重要作用。提高小麥糊粉層細(xì)胞清除H2O2的能力有助于延遲GA誘導(dǎo)的PCD的發(fā)生[29]。而且，Deng等[30]的研究表明，H2O2誘導(dǎo)的PCD是通過液泡介導(dǎo)實現(xiàn)的。

當(dāng)大麥糊粉層細(xì)胞中含有GA時，H2O2對介導(dǎo)GA信號的初級轉(zhuǎn)錄抑制子SLN1的降解不產(chǎn)生影響，但提高GAMyb mRNA的水平。CAMyb是作用于SLN1下游的因子，并參與α-淀粉酶mRNA的誘導(dǎo)。此外，H2O2還抑制PKABA mRNA的水平，而PKABA mRNA是通過ABA:PKABA抑制GAMyb mRNA誘導(dǎo)來的。可見，在大麥糊粉層細(xì)胞中由GA誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2是拮抗ABA信號的一個信號分子[31]。

4 NO、CO/HO-1對禾谷類種子糊粉層細(xì)胞程序性死亡發(fā)生的調(diào)節(jié)

一氧化氮(Nitric Oxide，NO)和一氧化碳(Carbon Monoxide，CO)均為生物體內(nèi)重要的氣體信號分子，對植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育等生理過程起著重要的調(diào)控作用。

NO可能是大麥糊粉層PCD過程中的一個內(nèi)源調(diào)節(jié)子[32]。種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的NO可能還與種子對ABA和GA的敏感性的改變有關(guān)[2]。外源NO供體硝普鈉(Sodium Nitroprusside，SNP)能延緩GA和ROS誘導(dǎo)的糊粉層PCD的進程[28,32]，減少CAT和SOD的損失，但并不影響GA誘導(dǎo)的α-淀粉酶的合成和分泌[32]。外源NO供體能緩解GA誘導(dǎo)的大麥糊粉層CAT和POD活性的下降，并延遲GA誘導(dǎo)的大麥糊粉層PCD的發(fā)生，而NO清除劑2-(4-羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物鉀鹽[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt，cPTIO]則逆轉(zhuǎn)NO供體維持細(xì)胞活力的效應(yīng)。BHT與NO供體有著類似的作用，均能延緩GA誘導(dǎo)大麥糊粉層細(xì)胞PCD的進程[32]。

李江[11]通過研究外源CO、NO對干旱脅迫下水稻種子的萌發(fā)、DNA降解及細(xì)胞存活率的影響，發(fā)現(xiàn)外源CO、NO供體可以有效提高干旱脅迫下萌發(fā)水稻種子糊粉層細(xì)胞的存活率，其效應(yīng)可以被各自專一性抑制劑鋅原卟啉(Zinc Protoporphyrin IX，ZnPPⅨ)或清除劑cPTIO所逆轉(zhuǎn)，同時CO的作用被NO專一性清除劑cPTIO所阻截，但CO合成酶抑制劑ZnPPⅨ卻無法阻擋NO減緩糊粉層細(xì)胞死亡的進程。因此，推測CO可能作用于NO信號途徑的上游，通過NO的介導(dǎo)延緩干旱誘導(dǎo)的糊粉層細(xì)胞DNA的降解和細(xì)胞死亡率的上升。

血紅素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)是血紅素分解代謝過程中的限速酶，它能使細(xì)胞內(nèi)的血紅素降解成CO和膽綠素。HO可以作為一道屏障抵抗脅迫，減少植物受到的氧化損傷，發(fā)揮類似激素的作用[33]。HO-1誘發(fā)劑高鐵血紅素(Hematin，Ht)可以顯著提高干旱脅迫下水稻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、芽長、根長及淀粉酶活性，顯著增加種子的可溶性蛋白含量和脯氨酸含量，并不同程度地誘導(dǎo)SOD、CAT和POD等抗氧化酶的活性[34]。Wu等[29]的研究表明，維持小麥糊粉層細(xì)胞中較高的HO表達(dá)水平對延緩PCD的發(fā)生是非常重要的。HO-1表達(dá)量及活性的提高可以降低H2O2含量，從而延緩GA對小麥糊粉層細(xì)胞PCD的誘導(dǎo)效應(yīng)。抗氧化劑BHT、DTT和AsA與高鐵血紅素和CO飽和溶液一樣具有緩解PCD和上調(diào)HO的表達(dá)的效應(yīng)。由GA誘導(dǎo)的小麥糊粉層PCD受到CO飽和溶液和HO-1誘導(dǎo)劑高鐵血紅素不同程度地阻緩[26]。

5 研究展望

種子萌發(fā)是受到許多內(nèi)部因子協(xié)同調(diào)控的一個復(fù)雜過程[35]。禾谷類作物糊粉層PCD是禾谷類作物種子萌發(fā)過程的關(guān)鍵性事件，它決定著種子能否正常萌發(fā)，幼苗能否正常生長。大量的研究證明，植物PCD是由一個基因群編制的程序嚴(yán)格控制的有序的復(fù)雜分子過程。此過程受細(xì)胞內(nèi)外多種信號系統(tǒng)的誘導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)多種基因的級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控，各種PCD的誘導(dǎo)因子和阻止PCD的存活因子作用于此級聯(lián)反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)。雖然目前已有大量的試驗證據(jù)表明GA是誘導(dǎo)禾谷類作物糊粉層PCD的關(guān)鍵因子，并且活性氧、氣體信號分子NO、CO等均參與此PCD過程的調(diào)控，但對這些因子間的相互作用機制仍不了解。

糊粉層PCD最顯著的特征是細(xì)胞液泡化。van Doorn等[36]認(rèn)為，細(xì)胞質(zhì)被吞沒及物質(zhì)被降解是液泡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中細(xì)胞解體的重要機制。而現(xiàn)今，關(guān)于“細(xì)胞液泡化的發(fā)生是被調(diào)控的？糊粉層細(xì)胞內(nèi)哪些基因的激活或抑制引發(fā)了PCD？”等問題仍不清楚，所以，目前仍無法清楚地闡述禾谷類糊粉層細(xì)胞死亡的機制。隨著對植物細(xì)胞程序性死亡的深入研究，相信在不久的將來，對植物PCD的生化途徑將有更進一步的認(rèn)識。

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