李三要，朱曉花，李科勇，劉海洋，湯佩芬

(1.湖南省邵陽市草地監(jiān)理站，湖南 邵陽 422000； 2.邵陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 邵陽 422000)

誘變和組織培養(yǎng)相結(jié)合，對(duì)擴(kuò)大遺傳變異、加速育種進(jìn)程、提高育種效率和改進(jìn)育種技術(shù)具有重要意義，所以輻射誘變組織培養(yǎng)復(fù)合育種技術(shù)近年來成為研究熱點(diǎn)[1-8]。結(jié)縷草是重要的草坪草，青島結(jié)縷草(Zoysiajaponicacv.Qingdao)、蘭引3號(hào)結(jié)縷草(Z.japonicacv.Lanyin 3)和馬尼拉結(jié)縷草(Z.matrella)是目前國(guó)內(nèi)結(jié)縷草資源開發(fā)利用中頗具代表性的結(jié)縷草品種。王文恩等[9]進(jìn)行了日本結(jié)縷草(Z.japonica)成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)，郭愛桂等[10]以狗牙根(Cynodondactylon)為材料，研究了輻照對(duì)其的影響。以傳統(tǒng)育種為基礎(chǔ)，后用新發(fā)展的生物技術(shù)，可以培育出抗旱、抗寒、耐高溫、耐鹽堿、抗病、抗蟲、耐踐踏、競(jìng)爭(zhēng)性強(qiáng)、耐陰、對(duì)污染物耐受性強(qiáng)、能穩(wěn)定遺傳的草坪草新品種、新品系。本研究將電離射線導(dǎo)入結(jié)縷草的愈傷組織誘導(dǎo)中，觀測(cè)其對(duì)結(jié)縷草愈傷組織分化的影響，希望能提高其愈傷組織的胚性轉(zhuǎn)化率，為建立這3個(gè)品(種)的高頻再生體系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 以蘭引3號(hào)結(jié)縷草(YJ)、馬尼拉結(jié)縷草(BJ)和青島結(jié)縷草(QJ)的莖基作為外植體材料，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及輻照誘變處理。

誘變處理源為60Co-γ射線，由江蘇省揚(yáng)州市農(nóng)科所輻照中心提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1愈傷組織誘導(dǎo) 取供試結(jié)縷草的莖基，置于配方為MS+2,4-D(2 mg·L-1)+6-BA(0.1 mg·L-1)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶放置10個(gè)，設(shè)5個(gè)重復(fù)，在(25±1)℃的條件下暗培養(yǎng)。

1.2.2輻照處理方法 將培養(yǎng)14 d的愈傷組織，進(jìn)行60Co-γ射線誘變處理，劑量梯度設(shè)為0、5、10、15、20、25、30和40 Gy，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)重復(fù)。劑量率為1.0 Gy·min-1。

1.3繼代培養(yǎng) 經(jīng)過誘變處理后的愈傷組織30 d繼代一次，統(tǒng)計(jì)愈傷組織死亡率、出愈率，并觀察愈傷組織生長(zhǎng)情況，80～85 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織形成率。

1.4胚性愈傷組織篩選 將篩選出的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.160Co-γ射線處理結(jié)縷草愈傷組織半致死劑量(LD50)的篩選 隨著輻照劑量的增加，3個(gè)(品)種愈傷組織的死亡率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)劑量大于25 Gy后，死亡率急劇升高，當(dāng)劑量上升為30 Gy時(shí)，3個(gè)結(jié)縷草(品)種愈傷組織的死亡率均超過50%，故30 Gy為其半致死劑量，并將在后續(xù)試驗(yàn)中加以應(yīng)用。當(dāng)劑量繼續(xù)升高至40 Gy后，愈傷組織死亡率均超過3/4，且剩下的愈傷組織均稍微發(fā)褐，故由結(jié)縷草QJ、YJ和BJ莖基誘導(dǎo)而出的愈傷組織，其輻射處理的適合劑量為1～30 Gy。3個(gè)(品)種之間比較而言，QJ在劑量為10、15、20 Gy時(shí)愈傷組織零死亡，與0 Gy無明顯差異；而YJ和BJ的愈傷組織輻射處理后，愈傷組織的死亡率明顯高于0 Gy，這可能是因?yàn)椴煌贩N愈傷組織的輻射敏感度不同(表1)。

表1 不同劑量下青島結(jié)縷草(QJ)、蘭引3號(hào)結(jié)縷草(YJ)和馬尼拉結(jié)縷草(BJ)愈傷組織死亡率比較Table 1 Comparison of callus death rate of QJ、YJ and BJ under different radiation doses

2.260Co-γ射線處理對(duì)出愈率及胚性愈傷組織形成率的影響 普遍認(rèn)為，輻照誘變處理，中低劑量處理能提高出愈率和幼苗分化率；相反，高劑量降低出愈率和分化率。如在輻照的水稻(Oryzasativa)和小麥(Triticumsativum)的花藥愈傷組織、成熟胚及幼穗中都觀察到出愈率的提高[11]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，低劑量時(shí)各(品)種的出愈率均高于0 Gy，說明小劑量輻照對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)具有刺激效應(yīng)， 但這種刺激效應(yīng)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸消失。劑量升高至25 Gy以后，愈傷組織出愈率急劇降低(圖1)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0 Gy，但(品)種之間的差異不明顯。胚性愈傷形成率方面，3個(gè)(品)種的胚性愈傷組織形成率隨著劑量的升高總體上呈現(xiàn)了先升后降的趨勢(shì)，20 Gy輻照處理時(shí)，QJ、YJ、 BJ愈傷組織的胚性形成率均達(dá)到峰值，分別為37.5%、76.5%和63.6%，分別較0 Gy高28.9%、60.8%和53.3%。在15 Gy劑量作用下，QJ、YJ和BJ也獲得了較高的胚性愈傷組織形成率，分別為35.7%、65.0%和55.0%。當(dāng)劑量升至25 Gy后，胚性愈傷形成率明顯降低，但較之出愈率，降幅較小(圖1)。可見，高劑量的輻射處理對(duì)出愈率的影響大于胚性愈傷組織形成率。

出愈率方面，5、10和20 Gy處理之間差異不明顯，但與0 Gy相比略有不同，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)、表面顆粒狀略顯干燥、白色絨毛的生成量大大減少，甚至沒有(表2)。繼代培養(yǎng)30～35 d后，個(gè)別愈傷塊褐化死亡。而25、30、40 Gy處理則大不相同。在輻照3～5 d后愈傷組織表面明顯干燥、灰暗，出現(xiàn)黃褐色，褐化程度隨輻照劑量的增大而加重，30 Gy處理在繼代培養(yǎng)25～30 d后愈傷組織嚴(yán)重褐化，各品種死亡率均超過50%，由此可知，此劑量為半致死劑量(LD50)。40 Gy處理在輻照后原培養(yǎng)基上培養(yǎng)第20-25天時(shí)大部分或全部都褐化死亡，死亡率超過70%。但經(jīng)30、40 Gy處理后未褐化的愈傷組織，在其底部有黃色或黃綠色誘變細(xì)胞體產(chǎn)生，體積增大明顯，上部原有愈傷組織呈黑褐色萎縮。

圖1 輻照對(duì)結(jié)縷草出愈率及胚性愈傷形成率的影響Fig.1 Effects of radiation on callus rate and embryogenic callus rate of Zoysia spp.

表2 不同劑量下的愈傷組織的形態(tài)變化Table 2 Callus morphological characterization under different radiation dose

總體來說，YJ的顆粒狀結(jié)構(gòu)最為明顯，其次為BJ，再次為QJ。在胚性愈傷誘導(dǎo)的后期，愈傷塊完全轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒌木G色顆粒物的集合體，同時(shí)可以觀察到白色或黃色突變體顆粒物的生成，顆?？捎描囎虞p輕剝離整體，同時(shí)若將這種松散顆粒的集合體轉(zhuǎn)入未添加任何外源激素的MS培養(yǎng)基中，則每一個(gè)綠色顆粒均可分化再生出一棵完整的結(jié)縷草再生植株。

3 討論與小結(jié)

3.1基因型對(duì)結(jié)縷草出愈率及胚狀體獲得的影響 QJ、YJ和BJ屬于不同的基因型，其遺傳背景有很大差異，采用常規(guī)方法培養(yǎng)其營(yíng)養(yǎng)器官及幼穗等，其愈傷組織形成、綠苗的分化和再生能力有很大差異。本試驗(yàn)所采用的QJ、YJ和BJ(品)種之間由于其基因型的不同，愈傷組織形成和綠苗分化再生能力也不同。QJ的莖基形成愈傷組織較容易，但產(chǎn)生綠苗極難，常規(guī)培養(yǎng)條件下綠苗分化率僅為9.09%，而YJ和BJ莖基的愈傷組織形成雖然難于QJ，但其綠苗再生較QJ要容易，常規(guī)培養(yǎng)下胚性愈傷誘導(dǎo)率分別為15.63%和10.33%。

根據(jù)“細(xì)胞的全能性”理論，每一個(gè)有活力的植物細(xì)胞都具有再現(xiàn)其完整植株的潛在能力。對(duì)于那些目前離體培養(yǎng)尚存在困難的草坪草品種，只是由于人們目前缺乏對(duì)它們的足夠認(rèn)識(shí)，還沒有找到一種能使其外植體材料形成愈傷組織和再生綠苗的方法和途徑[12-13]，并不一定是其本身缺乏出愈和再生能力。一旦找到了方法和途徑，就會(huì)改變這種植物的外植體材料不易出愈和再生的狀況。本研究中利用射線處理再生率極低的結(jié)縷草莖基愈傷組織后，使之胚性愈傷誘導(dǎo)率和再生率均大大提高。因此，不斷地研究、摸索和掌握不同草坪草品種在組織培養(yǎng)中的適宜條件，找到能有效促進(jìn)其愈傷組織形成和綠苗再生的方法和途徑，對(duì)于發(fā)揮和挖掘組織培養(yǎng)技術(shù)在草坪草遺傳改良中的作用和潛力具有十分重要的意義。

3.2誘變處理對(duì)結(jié)縷草胚狀體的誘導(dǎo) 根據(jù)電離輻射理論，生物機(jī)體受伽瑪射線等輻照后，會(huì)產(chǎn)生原始的生化損傷，代謝的方向性和協(xié)調(diào)性受到破壞，引起一系列生理和病理的變化。與此同時(shí)，機(jī)體在一定范圍內(nèi)進(jìn)行著反饋調(diào)節(jié)，通過修補(bǔ)和修復(fù)，減輕這些損傷并恢復(fù)原狀，在這一過程中就很容易產(chǎn)生基因的變異，這兩種相反過程的消長(zhǎng)和變化決定細(xì)胞的存活、死亡、老化、癌變等。當(dāng)劑量較低時(shí)，修復(fù)過程占據(jù)了主導(dǎo)地位。如在本研究中，射線處理劑量在5～20 Gy時(shí)，體現(xiàn)出來的是對(duì)結(jié)縷草莖基的胚性愈傷組織形成、綠苗分化和再生有明顯的促進(jìn)作用。處理劑量20 Gy對(duì)形成莖基胚性愈傷組織效果最好，如YJ品種的莖基經(jīng)射線處理后，胚性愈傷組織形成率增至64.71%，較0 Gy提高了48.80%；BJ的胚性愈傷形成率增至55.0%，較0 Gy提高了42.35%；QJ的胚性愈傷組織形成率增至37.5%，較0 Gy提高了35.11%。但當(dāng)射線輻照劑量繼續(xù)提高后，雖然對(duì)形成胚性愈傷組織和再生綠苗仍有促進(jìn)作用，但射線的損傷效應(yīng)也開始逐步增加，故綜合效應(yīng)表現(xiàn)為愈傷組織褐化死亡。

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