王薇，劉明東，顏有儀，葉懿，趙俊紅，熊卉，肖敏，廖林川

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都 610041）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基

王薇1，劉明東2，顏有儀1，葉懿1，趙俊紅2，熊卉1，肖敏1，廖林川1

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都 610041）

目的 建立靈敏、準(zhǔn)確的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測(cè)定肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法。方法肝組織勻漿液中加入內(nèi)標(biāo)地塞米松，用二氯甲烷提取后揮干，殘?jiān)尤爰状既芤喝芙獠⑸蠘拥絇roElut C18固相萃取柱上分離凈化，應(yīng)用HPLC-MS/MS正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定。結(jié)果肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基分別在1～204 ng/g和1～206 ng/g范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。檢測(cè)限（S/N≥3）均為0.3ng/g?；|(zhì)效應(yīng)為96.5%～126.7%。萃取回收率為70.0%～82.3%。日內(nèi)及日間精密度均小于10%。結(jié)論所建方法靈敏、可靠，能滿(mǎn)足法醫(yī)毒物分析的鑒定需要。

法醫(yī)毒理學(xué)；串聯(lián)質(zhì)譜法；高效液相色譜法；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基

華蟾酥毒基和酯蟾毒配基為蟾酥（由蟾蜍動(dòng)物頭、舌、肝、膽、耳后腺及皮膚腺的白色分泌物加工而成的固狀物）毒基類(lèi)的主要毒性成分，基本結(jié)構(gòu)為具有六元不飽和內(nèi)酯環(huán)的甾體化合物，是一類(lèi)乙型強(qiáng)心苷元的衍生物。蟾酥具有消腫、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、抗感染、抗腫瘤等功效，可內(nèi)服和外用，被廣泛用于傳統(tǒng)復(fù)方中藥制劑中。然而，蟾酥具有較強(qiáng)心臟毒性和細(xì)胞毒性，治療量和致死量相近，安全系數(shù)低，且中毒癥狀出現(xiàn)時(shí)間短。因此，偶有服用含蟾酥中藥或捕食蟾蜍造成中毒或死亡的案例報(bào)道[1-2]。

文獻(xiàn)[3-7]報(bào)道各類(lèi)復(fù)方中藥制劑中蟾酥毒基類(lèi)成分測(cè)定方法較多，有高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）等。生物檢材中蟾酥毒基類(lèi)成分的測(cè)定也有報(bào)道，研究對(duì)象多選用血液[8-13]，然而蟾酥毒基類(lèi)成分在血液中代謝速度快、消除半衰期短，在實(shí)際法醫(yī)學(xué)鑒定工作中，血液并不是最合適的檢材。與血液相比，選擇全身最大代謝器官的肝作為檢材更合理。目前僅有HPLC法檢測(cè)肝組織中蟾酥毒基類(lèi)成分的報(bào)道[14-15]，由于蟾酥中毒劑量小，組織中檢測(cè)難度高，需要靈敏度更高的檢測(cè)方法。因此，本研究選擇液-固萃取結(jié)合固相萃取的樣品前處理方法，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）對(duì)肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基進(jìn)行定性定量分析，并將此方法用于蟾酥中毒案件的鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent G6410A三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀配Agilent 1200液相色譜儀（美國(guó)Agilent Technologies公司），VisiprepTM固相萃取儀（美國(guó)Supelco公司），ProElut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL，北京迪馬科技有限公司）。

華蟾酥毒基對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110803-200605，含量按純品計(jì)），酯蟾毒配基對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110718-201102，含量98.9%），地塞米松對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100129-200804，含量99.6%），二氯甲烷（色譜純）、甲醇（色譜純），去離子水經(jīng)優(yōu)普純水系統(tǒng)制備。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18液相色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1；柱溫：30℃；流速：0.3mL/min。

表1 梯度洗脫條件

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）源，正離子模式；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：9.0 L/min；霧化氣壓力：275.8 kPa；毛細(xì)管出口電壓：4 000 V，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。檢測(cè)離子為華蟾酥毒基m/z 443.2→187.0（定量離子）、365.0，酯蟾毒配基m/z 385.2→105.0（定量離子）、349.0，內(nèi)標(biāo)地塞米松m/z 393.1→373.2（定量離子）、355.2。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱(chēng)取華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松對(duì)照品各適量，用甲醇分別配制成1.02、1.03和1.05mg/mL的儲(chǔ)備液，4℃冰箱保存。臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。

1.5 樣品預(yù)處理

稱(chēng)取空白勻漿肝組織1 g，向內(nèi)加入100 μL 0.84μg/mL地塞米松甲醇溶液（內(nèi)標(biāo)），混勻，用12mL二氯甲烷分3次提取，每次渦旋混合5 min，2 432×g離心5min，取下層提取液，合并提取液，置于40℃氮?dú)饬飨麓蹈?。殘?jiān)?00 μL甲醇溶解，并加入5 mL去離子水混勻，將上清液上樣到ProElut C18固相萃取柱，依次用3mL去離子水和2mL 10%甲醇溶液洗去雜質(zhì)，用3mL二氯甲烷洗脫待測(cè)組分，洗脫液置于40℃氮?dú)饬飨麓蹈?，殘?jiān)?.5mL甲醇溶解，9576×g離心10min后，取上清液10μL進(jìn)樣分析。

1.6 工作曲線(xiàn)、檢測(cè)限和定量限考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，加入系列質(zhì)量濃度華蟾酥毒基對(duì)照品溶液（0.010 2、0.020 4、0.051、0.102、0.204、0.510、1.02、2.04μg/mL）和酯蟾毒配基對(duì)照品溶液（0.0103、0.0206、0.0515、0.103、0.206、0.515、1.03、2.06μg/mL）各100μL，按照1.5項(xiàng)方法處理，在選定條件下進(jìn)行分析，分別以華蟾酥毒基和酯蟾毒配基與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（x）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，以S/N≥10時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為定量限，以S/N≥3時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢測(cè)限。

1.7 精密度考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，添加華蟾酥毒基對(duì)照品溶液（0.051、0.204、1.02 μg/mL）和酯蟾毒配基對(duì)照品溶液（0.0515、0.206、1.03 μg/mL）各100 μL，制得低、中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的質(zhì)控樣品，每一質(zhì)量分?jǐn)?shù)5份，按照1.5項(xiàng)方法處理，在選定條件下進(jìn)行分析。在同一天內(nèi)每一質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)測(cè)定5份質(zhì)控樣品，同法連續(xù)測(cè)定3d，得日內(nèi)精密度和日間精密度。

1.8 萃取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，添加低、中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的華蟾酥毒基對(duì)照品溶液和酯蟾毒配基對(duì)照品溶液，按照1.7項(xiàng)質(zhì)量濃度制備，每一質(zhì)量分?jǐn)?shù)5份，按照1.5項(xiàng)方法處理，以質(zhì)控樣品中待測(cè)物峰面積與空白檢材經(jīng)提取凈化后添加得相應(yīng)質(zhì)量濃度的待測(cè)物峰面積比得到萃取回收率。

取空白勻漿肝組織若干份各1g，按照1.5項(xiàng)方法提取凈化后，將洗脫液置于40℃氮?dú)饬飨聯(lián)]干，添加低、中、高質(zhì)量濃度的華蟾酥毒基對(duì)照品溶液和酯蟾毒配基對(duì)照品溶液，按照1.7項(xiàng)質(zhì)量濃度制備，置于40℃氮?dú)饬飨聯(lián)]干，殘?jiān)?.5mL甲醇定容，9576×g離心10min后進(jìn)樣分析。以空白肝提取凈化后添加樣品峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液峰面積比得到基質(zhì)效應(yīng)。

1.9 穩(wěn)定性考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，添加低、中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的華蟾酥毒基對(duì)照品溶液和酯蟾毒配基對(duì)照品溶液，按照1.7項(xiàng)質(zhì)量濃度制備，再按照1.5項(xiàng)方法處理后，分別將樣品置于室溫20～25℃中放置0、4、8h及-20℃放置0、1、3d后取樣測(cè)定，考察實(shí)驗(yàn)條件下樣品的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜圖

在上述選定的色譜條件下，肝組織添加樣品中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松分離良好，保留時(shí)間分別為7.709、8.130和4.541 min，HPLC-MS/MS總離子流圖見(jiàn)圖1，華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 華蟾酥毒基（A）、酯蟾毒配基（B）和地塞米松（C）的HPLC-MS/MS總離子流圖

圖2 華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 線(xiàn)性方程、檢測(cè)限和定量限

肝組織中華蟾酥毒基在1～204 ng/g范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.9995），線(xiàn)性方程為y=4.7377x+0.0122，檢測(cè)限為0.3ng/g，定量限為1.02ng/g；酯蟾毒配基在1～206 ng/g范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.999 8），線(xiàn)性方程為y=6.7222x+0.0188，檢測(cè)限為0.3ng/g，定量限為1.03ng/g。

2.3 精密度

肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基低、中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的質(zhì)控樣品的精密度見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的日內(nèi)精密度均小于3%，日間精密度均小于10%，方法精密度良好。

2.4 萃取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基低、中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的質(zhì)控樣品的萃取回收率和基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表3，結(jié)果表明，肝組織中低、中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的基質(zhì)效應(yīng)為96.5%～126.7%，萃取回收率為70.0%～82.3%。

表2 肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的精密度

表3 肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的基質(zhì)效應(yīng)和萃取回收率

2.5穩(wěn)定性

穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，于室溫20～25℃中放置4、8h的低、中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的質(zhì)控樣品與放置0h相比，肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量測(cè)定相對(duì)偏差均小于5%，而于-20℃放置1、3d與0d相比，相對(duì)偏差均小于10%，能夠達(dá)到生物檢材的分析要求，確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 案例應(yīng)用

某年3月13日，一名59歲婦女服用含蟾酥成分的中藥丸后出現(xiàn)不適，約3.5h后死亡。半年后取死者肝組織用本研究所建方法檢驗(yàn)，檢出華蟾酥毒基和酯蟾毒配基成分，其中華蟾酥毒基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.81ng/g。

在死者肝組織中也檢出酯蟾毒配基，但未達(dá)到定量限?？赡苁怯捎隗杆种滤懒枯^低，而檢材送檢時(shí)間與死者死亡時(shí)間相距已有半年，酯蟾毒配基發(fā)生降解，以及肝組織腐敗等原因造成的。

3 討論

3.1 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的選擇

本研究曾考察采用肝組織勻漿高速離心后，取上清液直接進(jìn)行固相萃取的前處理方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在色譜分析中，待測(cè)組分保留時(shí)間點(diǎn)共流出組分較多，即使調(diào)整流動(dòng)相比例也不能優(yōu)化分離，嚴(yán)重影響了離子化效率，且勻漿后取上清液上樣，萃取回收率僅為30%～40%。因此考慮在固相萃取之前增加液-固萃取的步驟，最終的分析結(jié)果顯示優(yōu)化后的萃取回收率提高到了70.0%以上。

在液-固萃取溶劑的選擇方面，考察了乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷3種溶劑。結(jié)果表明，乙醚和乙酸乙酯會(huì)提出較多油脂成分，提取液難以揮干，二氯甲烷極性較大，能相對(duì)減少對(duì)油脂類(lèi)成分的提取，減少雜質(zhì)干擾，提取液揮干時(shí)間也較短。

結(jié)合文獻(xiàn)[16]報(bào)道蟾酥毒基類(lèi)在甲醇和二氯甲烷中溶解度最好，考察了甲醇和二氯甲烷為洗脫溶劑的情況，結(jié)果表明，甲醇洗脫液中雜質(zhì)較多，回收率為60%左右，而二氯甲烷比甲醇能減少對(duì)雜質(zhì)的洗脫，降低共流出組分的干擾，回收率更高。預(yù)試驗(yàn)分段收集了前、中、后段各3mL洗脫液，結(jié)果顯示，前段洗脫液中兩種待測(cè)組分回收率分別為80%和73%，中、后段洗脫液中均未檢出兩種待測(cè)組分。

結(jié)合以上研究結(jié)果，選擇二氯甲烷為液-固萃取溶劑和洗脫溶劑，洗脫體積為3mL。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究比較了甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液兩種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，相對(duì)于乙腈-0.1%甲酸溶液，雖然甲醇-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)響應(yīng)高約20%，但柱壓較高，最高可達(dá)45 MPa，待測(cè)組分的峰形較差，影響了兩種待測(cè)組分的分離度，因此綜合考慮，選擇乙腈-0.1%甲酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)。由于待測(cè)組分極性較小，需要用大比例有機(jī)相洗脫，等度洗脫情況下峰分離度較差，因此選用梯度洗脫的方法分離待測(cè)組分。本研究同時(shí)考察了30、40和50℃下待測(cè)組分的色譜行為，最終結(jié)果顯示無(wú)明顯差別。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

結(jié)合蟾酥毒基類(lèi)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，考察了兩種甾體化合物地塞米松和潑尼松龍作為內(nèi)標(biāo)的情況，結(jié)果顯示兩者回收率均為75%～80%，與待測(cè)物近似且穩(wěn)定，而地塞米松在選定的試驗(yàn)條件下保留時(shí)間與待測(cè)物更接近，因此選擇地塞米松作為內(nèi)標(biāo)。

綜上，本研究所建立的運(yùn)用HPLC-MS/MS法檢測(cè)肝組織中兩種蟾酥毒基成分的方法，靈敏、可靠，與參考文獻(xiàn)[12-13]相比，在定量限及檢測(cè)限方面都有了較大進(jìn)步，適用于法醫(yī)毒物分析鑒定工作。

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Determination of Cinobufagin and Resibufogenin in Liver Tissue by HPLC-MS/MS

WANG Wei1,LIU Ming-dong2,YAN You-yi1,YE Yi1,ZHAO Jun-hong2,XIONG Hui1,XIAO Min1,LIAO Lin-chuan1
（1.West China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,China; 2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China）

ObjectiveTo develop a sensitive and accurate assay for detecting cinobufagin and resibufogenin in liver tissue using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）. Methods The homogenization of liver tissue with internal standard dexamethasone was extracted with dichloromethane.The extracts with methanol were purified through ProElut C18solid phase extraction and tested in positive electrospray ionization with multiple reaction monitoring of HPLC-MS/MS.ResultsThe good linear relationship of cinobufagin and resibufogenin in liver tissue were 1-204ng/g and 1-206ng/g, respectively.The minimal detection threshold（S/N≥3）of this method was 0.3ng/g for both cinobufagin and resibufogenin.The matrix effect was 96.5%-126.7%.The extraction recovery coefficient was 70.0%-82.3%. The precision of intra-day and inter-day was less than 10%.ConclusionThis method is sensitive and reliable,and can be used in forensic toxicological analysis.

forensic toxicology;tandem mass spectrometry;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;cinobufagin;resibufogenin

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.008

1004-5619（2013）04-0268-05

2012-10-16）

（本文編輯：劉偉）

王薇（1986—），女，四川瀘州人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)毒物分析研究；E-mail：freja_v@163.com

廖林川，男，博士，教授，主要從事法醫(yī)毒物分析教學(xué)及科研工作；E-mail：linchuanliao@scu.edu.cn