劉富英 竇文淵 譚秀連

（1廣東省中醫(yī)院，廣州510120；2中國(guó)廣州分析測(cè)試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510070）

HPLC法測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

劉富英1竇文淵2譚秀連1

（1廣東省中醫(yī)院，廣州510120；2中國(guó)廣州分析測(cè)試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510070）

目的 建立HPLC法測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量的方法。方法采用WelchC18色譜柱（4.6mm×250nm，5μm），流動(dòng)相：以水-乙腈進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流速為1.0ml／min，柱溫為35℃。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷在19.6～392μg／mL濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系（r＝0.9998，n＝6），平均加樣回收率為96.5%，RSD＝1.1%（n＝6）。結(jié)論本法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制。

HPLC；補(bǔ)中益氣丸；毛蕊異黃酮葡萄糖苷

補(bǔ)中益氣丸，是由炙黃芪、黨參、炙甘草、白術(shù)（炒）、當(dāng)歸、升麻、柴胡、陳皮共八味草藥加工而成的傳統(tǒng)中成藥，該成藥為棕褐色至黑褐色的小蜜丸或大蜜丸。功能與主治：補(bǔ)中益氣，升陽舉陷。用于脾胃虛弱、中氣下陷所致的體倦乏力、食少腹脹、便溏久瀉、肛門下墜［1］。研究表明黃芪異黃酮化合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用［2］。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是2010年《中國(guó)藥典》中黃芪的新增的檢測(cè)成分，同時(shí)也是衡量黃芪質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。黃芪是補(bǔ)中益氣丸處方中的君藥，因此，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量是補(bǔ)中益氣制劑一個(gè)重要的成分檢測(cè)指標(biāo)。以往文獻(xiàn)報(bào)道毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定，主要是高效液相色譜法［3-10］，高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法［11-12］，高效毛細(xì)管電泳二極管陣列法［13］，但未有文獻(xiàn)報(bào)道以HPLC測(cè)定補(bǔ)中益氣丸制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。因此，筆者采用HPLC測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，為有效控制該制劑質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試劑

日本島津LC-20AB液相色譜儀（包括二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，控溫箱，控制系統(tǒng)）；SPD-M20A PDA檢測(cè)器；島津LC solution色譜工作站。毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（購于中國(guó)藥品生物制品檢定所，≥98%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司），水為高純水。樣品：補(bǔ)中益氣丸，由吉林修正集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，（規(guī)格：9g／粒，批號(hào)：20120201、20120202、20120203、20120301、20120302、20120303）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱WelchC18色譜柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A：0.5%甲酸，流動(dòng)相B：乙腈；梯度程序：0～10 min，10～40%B；10.1～20min，40～10%B.檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；流速：1.0ml／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量10μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品10.00mg，置25ml容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷392μg／ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取樣品20個(gè)，研細(xì)，混勻。取精密稱量約5.0g，加入重量1／2的硅藻土，混勻，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100ml，稱定重量，加熱回流4h，放冷，搖勻，濾過，精密量取過濾液50ml，回流溶劑至干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?ml，用濾膜過濾，配制成供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備按補(bǔ)中益氣丸處方比例，制成缺毛蕊異黃酮葡萄糖苷的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法配成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)對(duì)照溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液分別進(jìn)樣10μl，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖（見圖A、B、C）。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷不低于4000，供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰與前后峰分離度均大于1.5，且陰性樣品無干擾。

圖A 對(duì)照品高效液相色圖譜

圖B 供試品高效液相色圖譜

圖C 陰性樣品溶液高效液相色圖譜

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)精密量取392μg／ml的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照溶液0.5，1.0，2.5，5.0，7.5ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為19.6、39.2、98.0、196、288、392μg／ml的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照溶液，進(jìn)樣10μl，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A＝1916C＋8890，相關(guān)系數(shù)r＝0.9998（n＝6）。結(jié)果表明毛蕊異黃酮葡萄糖在19.6～392μg／ml濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)取批號(hào)為“2.2.1”對(duì)照品溶液進(jìn)樣10μl，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液峰面積的RSD＝0.72%（n＝6），表明此儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取新配制的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣10μl，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，結(jié)果RSD＝0.95%，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取本品適量（批號(hào)：20120301），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，計(jì)算含量RSD為0.85%（n＝6），表明此方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)取同一批號(hào)（批號(hào)：20120301）的樣品6份，各精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果，RSD＝0.70%，表明此方法準(zhǔn)確可靠。見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定取6個(gè)不同批次的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量（見表2），6批樣品的含量均≥0.1mg／g。

表1 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n＝6）

表2 樣品的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

以往高效液相測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖的含量的文獻(xiàn)中，洗脫條件為等度和梯度洗脫，大多數(shù)色譜條件洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，筆者也嘗試過，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣丸成分較多，等度洗脫不能滿足實(shí)驗(yàn)要求，經(jīng)過多次試驗(yàn)，最后選擇0.5%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫效果最理想。

通過SPD-M20A PDA檢測(cè)器對(duì)在190～800nm范圍進(jìn)行掃描，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖對(duì)照品溶液和樣品圖譜，其中260nm處有較大吸收，因此，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇260nm。

炙黃芪為黃芪的炮制品，黃芪是豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根，在春節(jié)和秋季采挖。不同批次產(chǎn)品測(cè)出含量個(gè)別相差較大，分析原因可能是由于原材料蒙古黃芪或莢膜黃芪黃芪的干燥根采摘年限和季節(jié)的差異，以及黃芪生長(zhǎng)環(huán)境影響。在一定年齡階段內(nèi)，毛蕊異黃酮葡萄糖含量隨年齡增高而升高，在生長(zhǎng)至6年左右時(shí)，毛蕊異黃酮葡萄糖含量達(dá)到最高，之后毛蕊異黃酮葡萄糖含量又開始下降。在同樣條件下，野生和園林的黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖含量明顯比種植的黃芪高，秋季花莖凋枯后是黃芪采摘的最好季節(jié)，因此，根據(jù)中藥特點(diǎn)去采摘才能更好利用中藥的寶貴資源。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］．2010年版．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：780-781．

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Determination of Calycosin-7-glucoside in Buzhong Yiqi Pills by HPLC

L iu Fuying1Dou W enyuan2Tan Xiulian1
（1 Guangdong Hospital of Traditional Chinese M edicine,Guangdong Province,Guangzhou,510120,China；2 Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangdong Province,Guangzhou,510070,China）

Objective To establish HPLC method for determination of BuzhongYiqi pills of Calycosin-7-glucoside content．MethodsWelch C18（4．6mm×250mm，5μm）was used，the mobile phase was a mixture of water-acetonitrile as mobile phase with gradient elution with the flow rate was 1.0ml／min，260nm as the decection wavelength and column temperature was 35℃．ResultsSalidroside showed good linear relationship at the range of 19.2μg／ml to 392μg／ml（r＝0.9998，n＝6）．The average recovery was 96.5%（n＝6），RSD＝0.97%（n＝6）．ConclusionThe method appeared to be simple，convenient and precise，and can be used for control of BuzhongYiqi Pills．

HPLC；BuzhongYiqi pills；Calycosin-7-glucoside

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.23.117

：1672-2779（2013）-23-0160-02

蘇 玲

2013-10-25）