李 琦，梅其柄，張明杰，黃慶生,*

(1.西北工業(yè)大學生命學院，空間生物實驗?zāi)M技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710072；2.西北工業(yè)大學生命學院實驗中心，陜西 西安 710072)

一組生物活性多糖對人NK 細胞免疫活性的影響

李 琦1,2，梅其柄1，張明杰1，黃慶生1,*

(1.西北工業(yè)大學生命學院，空間生物實驗?zāi)M技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710072；2.西北工業(yè)大學生命學院實驗中心，陜西 西安 710072)

目的：探討體外環(huán)境中灰樹花、香菇、靈芝、枸杞多糖和酵母葡聚糖對人自然殺傷(NK)細胞的形態(tài)、增殖、細胞毒活性和IFN-γ分泌水平的影響。方法：采用經(jīng)體外擴增的高純度人NK細胞為模型，將5種多糖以100mg/L和50mg/L兩個質(zhì)量濃度組分別對其作用72h后檢測NK細胞的形態(tài)、增殖、細胞毒活性和IFN-γ分泌水平。結(jié)果：經(jīng)過多糖處理后的NK細胞增殖情況與對照組相比并未發(fā)生明顯改變，但細胞形態(tài)有一定的變化，且細胞毒活性和IFN-γ分泌水平有所提高。其中100mg/L和50mg/L的靈芝多糖處理能將NK細胞毒活性分別提高5.89%和9.1%(P＜0.05)，且50mg/L的灰樹花多糖和枸杞多糖也能將NK細胞毒活性分別提高5.7%和6.9%(P＜0.05)。另外50mg/L的灰樹花多糖與香菇多糖處理能將NK細胞IFN-γ的分泌水平分別提高255pg/mL和202pg/mL(P＜0.05)。結(jié)論： 灰樹花、靈芝和枸杞多糖在體外實驗中能在一定程度上提高NK細胞的細胞毒活性，但這種作用并不是通過促進細胞增殖實現(xiàn)的。另外灰樹花和香菇多糖也能通過促進NK細胞對IFN-γ的分泌，影響NK細胞的免疫調(diào)節(jié)功能。

人NK細胞；多糖；細胞毒活性；IFN-γ

多糖是醛糖或(和)酮糖通過糖苷鍵鏈接在一起的多聚物，廣泛存在于動物細胞膜和植物、真菌的細胞壁中，其中食(藥)用多糖被稱為生物應(yīng)答效應(yīng)物(biological response modifier，BRM)，是能夠增強人體免疫功能的生物活性物質(zhì)。近年來，食(藥)用多糖的結(jié)構(gòu)、功能、生物活性、作用靶點等得到國內(nèi)外學者的廣泛研究，成為分子生物學、醫(yī)學、食品科學等領(lǐng)域的研究熱點之一?；覙浠?Grifola frondosa)又名舞茸，是新近開發(fā)的一種食藥兩用菌，灰樹花多糖(Grifola frondosa polysaccharide，GFP)，是從灰樹花菌的子實體或菌絲體中分離得到的一類富含β-1, 6-及β-1,3-糖苷鍵的真菌多糖，具有顯著的防癌抗癌，提高免疫力之功效[1]。香菇(Lentinula edodes)是傳統(tǒng)食用菌，香菇多糖(lentinan，LNT)是從香菇的子實體中分離得到的具β- 1, 6-支鏈和β-1,3-支鏈的β-1,3葡聚糖，分子式為(C6H10O5)n，具有刺激干擾素(interferon，IFN)形成、抗病毒和抗腫瘤等功能[2]。靈芝(Ganoderma lucidum)是著名的藥用真菌，靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP) 結(jié)構(gòu)中單糖之間的連接方式，主鏈以β-1,3-、β-1,4-糖苷鍵連接，支鏈以β-1,6-糖苷鍵連接。現(xiàn)代藥理學研究認為GLP具有較強的提高免疫力和抗腫瘤的作用[3-4]。枸杞(Lycium chinense Miller)是我國傳統(tǒng)名貴中藥，其提取物枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)是由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖等6種多糖組成的雜多糖同多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合多糖，其糖鏈呈多分枝的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，具有增強免疫力、防衰老、增強造血功能、防止遺傳損傷等作用[5]。酵母葡聚糖(yeast glucan，YG)的主要成分是β-1,3-D-葡聚糖，約占酵母細胞壁干質(zhì)量的20%。YG是一種極富生物活性的多糖，它表現(xiàn)出很強的刺激免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射等活性和降血糖降血脂等多種功效[6]。上述5種多糖具有突出的提高免疫力和抗腫瘤等生物活性，近年來得到廣泛關(guān)注，相關(guān)研究和應(yīng)用成果層出不窮。

自然殺傷(nature killer，NK)細胞是一種大顆粒淋巴細胞，無需預(yù)先致敏和抗體參與即可識別和殺滅腫瘤細胞、病毒感染細胞和較大的病原體(如真菌和寄生蟲)，并能分泌IFN-γ等可溶性細胞因子，通過活化中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞觸發(fā)特異性免疫應(yīng)答[7]。NK細胞在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的免疫監(jiān)控作用，也是人體抵御外來微生物入侵的第一道防線。因此，尋找和開發(fā)能夠提高NK細胞免疫活性的因子或藥物有著重要的理論與實踐意義。

考慮到NK細胞在人體非特異和特異性免疫過程中所起的重要作用，上述5種多糖在發(fā)揮提高免疫力和抗腫瘤等功效時是否涉及對NK細胞功能的影響就成為一個有趣的問題。本研究通過體外實驗，檢測了GFP、LNT、GLP、LBP和YG對NK細胞的形態(tài)、增殖、細胞毒活性及IFN-γ分泌水平的影響，以期找尋其中能夠上調(diào)NK細胞免疫活性的成分，為多糖的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人外周抗凝血分別來自8位健康獻血者(男3人，女5人)其中年齡最大49歲，最小25歲，平均年齡33歲；K562細胞株(人髓源白血病細胞株，CCTCC編號：GDC037)購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；K562D3工程細胞株，由本研究室構(gòu)建(采用基因工程的方法，在K562細胞株上同時表達IL-15、IL-18和4-1BBL基因，用于NK細胞的體外擴增，詳見文獻[8])。

GFP、LNT、GLP、LBP(純度均≥60%) 浙江方格藥業(yè)有限公司；羧甲基化的酵母葡聚糖(純度≥99%)珠海天添生物工程技術(shù)有限公司；RPMI-1640完全培養(yǎng)基 美國Gibco公司；小牛血清 杭州四季青公司；淋巴細胞分離液 上海華精生物高科技有限公司；cell counting Kit-8 活細胞計數(shù)試劑盒 日本Dojindo公司；IL-2 美國Peprotech公司；人IFN-γ ELISA檢測試劑盒美國R&D公司；抗人CD56-PE、CD3-FITC特異性抗體及同型對照 美國BD Biosciences公司；其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；倒置顯微鏡重慶光學儀器廠；超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠；TD5A-WS大容量臺式低速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；多功能酶標儀 美國BioTek公司；高壓滅菌設(shè)備 日本三洋電機公司；BD FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 NK細胞的擴增培養(yǎng)

新鮮抽取的人外周抗凝血，用淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，滅菌PBS洗3次，用含10% FBS和1h106U/L可溶性IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞懸浮，加入6孔板中，每孔約1h107個細胞。隨后每孔加入經(jīng)γ射線照射滅活的K562D3細胞1h107個，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從培養(yǎng)的第2周起每2d對培養(yǎng)孔中的液體進行半換液。培養(yǎng)21d后收獲細胞，取其中少量細胞進行流式分析，確定其中CD56+CD3—(NK)細胞的比例(NK細胞擴增方法詳見文獻[8])。

1.3.2 5種多糖的處理

5種多糖分別用RPMI-1640無血清培養(yǎng)基配成質(zhì)量濃度為10g/L和5g/L的100h儲存液，一次性濾器過濾除菌。將擴增培養(yǎng)好的NK細胞取出，滅菌PBS洗3遍，用含10% FBS、不含IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸(為了摒除IL-2對NK細胞的影響，除擴增用培養(yǎng)基外，所有實驗用1640培養(yǎng)基均不含IL-2)，調(diào)整細胞密度為2h107個/mL。使用24孔板，每孔中加入1mL細胞懸液，再加入1%體積的多糖溶液，使各種多糖的終質(zhì)量濃度分別為100mg/L和50mg/L，每次實驗均設(shè)不含任何多糖的陰性對照組。將所有細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

1.3.3 NK細胞增殖情況檢測

將多糖處理后的各組NK細胞懸液充分混勻，每組取出100μL (約2h106個細胞)加入1.5mL EP管并離心，用滅菌PBS洗2次后重新加入新培養(yǎng)基200μL充分混勻。使用96孔板，將每個EP管中的200μL細胞懸液加入96孔板中，每孔再加入20μL cell-counting試劑，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，于450nm波長處測定吸光度(A)，比較實驗組與空白對照組的A450nm。

1.3.4 NK細胞殺傷率檢測

將多糖處理后各孔剩余NK細胞分別取出離心，收集上清備用，離心下來的細胞用滅菌PBS洗2次，活細胞計數(shù)。NK細胞的細胞毒活性以NK細胞對K562細胞的殺傷率表示：使用96孔板，每個反應(yīng)孔加入2h106個NK細胞和4h105個K562細胞，使NK細胞:K562細胞(效靶比) = 5:1(每個反應(yīng)孔重復(fù)3次)，并設(shè)單獨的NK細胞孔和單獨K562細胞孔。將每孔的培養(yǎng)基體積補至200μL。細胞加好后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后取出，每孔再加入20μL cell-counting試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h，450nm波長處測定吸光度(A)，計算NK細胞的殺傷率。

式中：Ae為NK細胞孔的吸光度；At為K562細胞孔的吸光度；Ae+t為NK細胞+K562細胞孔的吸光度。

1.3.5 NK細胞IFN-γ分泌水平檢測

將前面收集的各實驗組NK細胞培養(yǎng)上清液取出，按照人IFN-γ ELISA試劑盒說明書上的步驟測定上清液中IFN-γ的含量。將標準品吸光度用Curve Expert軟件作出曲線，利用曲線將實驗組吸光度換算成IFN-γ的質(zhì)量濃度值。比較實驗組與空白對照組IFN-γ的質(zhì)量濃度。

1.3.6 NK細胞的形態(tài)學變化

獲得多糖處理前后NK細胞的光鏡照片，并觀察NK細胞形態(tài)變化。

1.3.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增培養(yǎng)后NK細胞的純度

流式分析結(jié)果(圖1，舉例說明)顯示，經(jīng)體外擴增培養(yǎng)21d后，NK (CD56+CD3—)細胞占細胞總數(shù)的平均值為(96.67f3.54)% (n=4)，說明PBMC中的其他細胞經(jīng)過21d的體外培養(yǎng)已基本死亡，所獲得的NK細胞純度能夠達到實驗要求。

圖 1 擴增后的PBMC流式分析結(jié)果Fig.1 Flow cytometry analysis of PBMCs after expansion

2.2 5種多糖對NK細胞增殖的影響

表 1 5種多糖處理后NK細胞的吸光度(±s,n＝8)Table 1 Effect of fi ve polysaccharides on the proliferation of NK cells±s,n＝8)

表 1 5種多糖處理后NK細胞的吸光度(±s,n＝8)Table 1 Effect of fi ve polysaccharides on the proliferation of NK cells±s,n＝8)

多糖組別NK細胞吸光度100mg/L組50mg/L組GFP組0.761f0.2430.816f0.212 LNT組0.773f0.1470.793f0.189 GLP 組0.808f0.1740.785f0.211 LBP組0.767f0.2230.650f0.330 YG組0.783f0.2180.754f0.227空白對照組0.772f0.202

由表1可見，在5種多糖100mg/L和50mg/L 兩種質(zhì)量濃度條件下分別處理72h后，NK細胞的吸光度與空白對照組相比并沒有明顯的差異(P＞0.05)。由此可知，兩種質(zhì)量濃度的多糖體外處理不會對NK細胞產(chǎn)生明顯的促進增殖或毒性作用。

2.3 5種多糖對NK細胞毒活性的影響

表 2 5種多糖處理后NK細胞的殺傷率(±s, n＝8)Table 2 Effect of fi ve polysaccharides on the cytotoxicity of NK cells (±s,n＝8)

表 2 5種多糖處理后NK細胞的殺傷率(±s, n＝8)Table 2 Effect of fi ve polysaccharides on the cytotoxicity of NK cells (±s,n＝8)

注：*.與空白對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。下同。

多糖組別NK細胞殺傷率/% 100mg/L組50 mg/L組GFP組65.60f9.5469.81f9.49* LNT組62.48f8.0765.58f8.64 GLP 組70.03f9.77*73.24f8.13* LBP組63.48f8.9071.06f9.79* YG組65.32f9.9167.19f11.02空白對照組64.14f9.11

由表2可見，經(jīng)過72h的處理，100mg/L和50mg/L的GLP、50mg/L的GFP和LBP對NK細胞的細胞毒活性有一定的增強作用(P＜0.05)。其中50mg/L和100mg/L的GLP能將NK細胞毒活性分別提高9.1%和5.89%，50mg/L的GFP和LBP能將NK細胞毒活性分別提高5.7%和6.9%(P＜0.05) 。

2.4 5種多糖對IFN-γ分泌水平的影響

由表3可見，經(jīng)過72h的處理，50mg/L的GFP和LNT能將NK細胞的IFN-γ分泌水平分別上調(diào)255pg/mL和202pg/mL(P＜0.05)，對其免疫活性有一定的增強作用。

表 3 5種多糖處理后NK細胞的IFN-γ分泌水平(±s,n＝8)Table 3 Effect of fi ve polysaccharides on the IFN-γsecretion of NK cells (s,n＝8)

表 3 5種多糖處理后NK細胞的IFN-γ分泌水平(±s,n＝8)Table 3 Effect of fi ve polysaccharides on the IFN-γsecretion of NK cells (s,n＝8)

多糖組別NK細胞IFN-γ分泌水平/(pg/mL) 100mg/L組50mg/L組GFP組942f1831243f210* LNT組996f1911190f236* GLP組974f2431023f234 LBP組895f211917f191 YG組937f236990f211空白對照組988f201

2.5 多糖處理前后NK細胞形態(tài)的變化

圖 2 多糖處理前后NK細胞形態(tài)變化Fig.2 Morphological changes of NK cells after treatment with 50 mg/L Ganoderma lucidum polysaccharide

由圖2A可知，較之未經(jīng)處理的NK細胞，經(jīng)過50mg/L GLP 處理72h后，NK細胞顯得更加飽滿，體積稍有增大，細胞聚團現(xiàn)象增多(圖2B箭頭所示)，說明細胞活性有所增強。

3 討 論

多種因子可通過調(diào)節(jié)NK細胞介導(dǎo)的非特異性殺傷作用影響人體的免疫功能。為了尋找能提高NK細胞活性的多糖種類，本實驗選取了5種經(jīng)研究證實具有明顯抗腫瘤和提高人體免疫力等生物活性的多糖成分，檢測了它們在體外實驗中對人NK細胞的形態(tài)、增殖、細胞毒活性和IFN-γ分泌水平的影響。通過參考文獻[9]，將多糖的質(zhì)量濃度設(shè)為100mg/L和50mg/L兩個劑量組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種多糖中提高NK細胞毒活性效果最好的是GLP，其在兩個劑量時都能明顯提高NK細胞對K562細胞的殺傷率，但在質(zhì)量濃度為50mg/L時效果更好。而50mg/L的GFP和LBP也顯示出較明顯的提高NK細胞毒活性的效果。但對應(yīng)的100mg/L質(zhì)量濃度卻無此效果，說明50mg/L是較適宜的多糖處理劑量，更高的質(zhì)量濃度反而會削弱多糖對NK細胞毒活性的增強作用。同時，50mg/L GFP和LNT能在一定程度上增加NK細胞對IFN-γ的分泌水平從而提高NK細胞的免疫活性。通過檢測NK細胞的增殖情況可以看出，多糖對NK細胞毒活性的增強作用并不是通過促進NK細胞的增殖而達到的。說明多糖可能通過影響NK細胞的其他生理指標來提高它的細胞毒活性。

本實驗所采用的5種多糖中，灰樹花多糖、香菇多糖、靈芝多糖和酵母葡聚糖這4種多糖中均具有β-1,6-及β-1,3-糖苷鍵，而枸杞多糖是一種復(fù)合的蛋白多糖，其中也具有β-糖苷鍵結(jié)構(gòu)。說明β-1,6-及β-1,3-糖苷鍵可能是影響NK細胞免疫活性的重要結(jié)構(gòu)。而實驗中發(fā)現(xiàn)，除酵母葡聚糖外，其他4種多糖均能對NK細胞免疫活性產(chǎn)生影響，或能直接提高NK細胞對靶細胞的細胞毒活性，或能提高NK細胞IFN-γ的分泌水平。暗示了此種對NK細胞免疫活性的刺激作用在生物活性類多糖中可能是廣泛存在的。由于酵母葡聚糖難溶于水，所以本實驗中采用了可溶于水的羧甲基化酵母葡聚糖，但未發(fā)現(xiàn)對NK細胞免疫活性的影響，或許羧甲基化的處理會影響酵母葡聚糖的生物活性。

近年來，人們對多糖生物活性的認識逐漸增加，總結(jié)前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多糖具有明顯的提高生物免疫力和抗腫瘤的活性，主要表現(xiàn)為：1)直接抑制腫瘤細胞的生長。2)提高T、B淋巴細胞的增殖能力和活性。3)增加巨噬細胞的吞噬能力等[10-13]。有關(guān)多糖對NK細胞功能影響，Yuki等[14]研究發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖中的有效成分MD-Fraction能促進小鼠NK細胞的細胞毒活性，抑制腫瘤的生長。Rafique等[15]認為香菇多糖能夠減緩化療對小鼠肝臟NK細胞活性的破壞作用。目前以人NK細胞為研究對象的相關(guān)文獻還較少，本實驗以NK細胞體外擴增技術(shù)為平臺，初步研究了5種多糖對NK細胞功能的影響，找出了其中能夠上調(diào)NK細胞毒活性的成分與合適的處理質(zhì)量濃度。此結(jié)果暗示了多糖亦能夠通過提高NK對腫瘤細胞的細胞毒作用和對IFN-γ的分泌水平而起到增強免疫力和抗腫瘤的效果。下一步的工作當瞄準多糖影響NK細胞活性的機理進行深入研究，以進一步明確多糖的作用機理與靶標，為開發(fā)更具針對性的免疫增強藥物提供依據(jù)。

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Effects of Bioactive Polysaccharides on Immunocompetence of Human NK Cells

LI Qi1,2，MEI Qi-bing1，ZHANG Ming-jie1，HUANG Qing-sheng1,*
(1. Key Laboratory for Space Bioscience and Biotechnology, School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi? an 710072, China；2. The Central Laboratory, School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi? an 710072, China)

Objective: To determine the effects of Grifola frondosa polysaccharide, lentinan, Ganoderma lucidum polysaccharide, Lycium barbarum polysaccharide and yeast glucan on the morphology, proliferation, cytotoxicity and IFN-γ secretion of human NK cells. Methods: Pure human NK cells, prepared by PBMC based ex vivo expansion, were treated with each polysaccharide at concentrations of 100 mg/L and 50 mg/L, respectively. The proliferation, cytotoxicity and IFN-γ secretion of NK cells were tested after 72 h treatments. Results: No signif i cant changes in the proliferation of NK cells were observed between polysaccharide treatment groups and control group. However, increased cytotoxicity of NK cells could be observed for four polysaccharide treatment groups and some changes in cell morphology were also detected. The cytotoxicity of NK cells increased by 5.89% and 9.1% (P＜0.05) after treatment with 100 mg/L and 50 mg/L of Ganoderma lucidum polysaccharide, and increased by 5.7% and 6.9% (P＜0.05) after treatment with 50 mg/L of Grifola frondosa polysaccharide and Lycium barbarum polysaccharide, respectively. In addition, the IFN-γ secretion of NK cells increased by 255 pg/mL and 202 pg/mL (P＜0.05) separately after treatment with 50 mg/L of Grifola frondosa polysaccharide and lentinan. Conclusion: Grifola frondosa polysaccharide, Ganoderma lucidum polysaccharide and Lycium barbarum polysaccharide enhances the cytotoxicity of NK cells, but not by promoting its proliferation. Grifola frondosa polysaccharide and lentinan promote the IFN-γ secretion to a certain extent in vitro and thus have immunoregulatory effects on NK cells.

human NK cells；polysaccharide；cytotoxicity；IFN-γ

TS201.2

A

1002-6630(2013)01-0315-04

2011-10-06

李琦(1981ü)，女，實驗師，碩士，研究方向為細胞免疫學。E-mail：caddie_liqi@126.com

*通信作者：黃慶生(1963ü)，男，副教授，博士，研究方向為細胞免疫學。E-mail：qingshengh@yahoo.com.cn