吳新宇,李格,鄭群,樊新民

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系,新疆,832003)

新疆野生羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)條件初探

吳新宇,李格,鄭群,樊新民

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系,新疆,832003)

以新疆野生黑脈羊肚菌菌株為材料，在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)其在培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)方式、最適pH值、光照條件、培養(yǎng)基及其營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行了初步研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，在棕色瓶內(nèi)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng)是最佳培養(yǎng)方式，最適pH值為7.5，最適培養(yǎng)基為4，即黃豆芽200 g（煮汁）、蔗糖20 g、玉米粉5 g、水1 000 mL。

黑脈羊肚菌；液體培養(yǎng)；菌絲

黑脈羊肚菌[1]是一種食用兼藥用價(jià)值很高的大型真菌,其氨基酸含量為各食用菌之首,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)副腎皮激素的分泌、降低膽固醇、預(yù)防動(dòng)脈血管硬化、抗疲勞、抗病毒、抑制肌癌180等諸多作用。由于在食用、藥用等方面的重要價(jià)值,羊肚菌深受各國消費(fèi)者的青睞,國內(nèi)外市場一直很好[2]。但因生長條件的限制因素諸多,其野生產(chǎn)量極低且不能完全進(jìn)行人工栽培,故價(jià)格十分高昂。

羊肚菌在我國已報(bào)道有15種,新疆就占有8個(gè)種[3],我區(qū)是野生羊肚菌的主要分布區(qū)。雖是主要產(chǎn)區(qū),但由于我區(qū)特定的環(huán)境條件,野生羊肚菌出菇時(shí)期集中,市場供應(yīng)期短,有些極端干旱年份甚至不發(fā)生,根本無法滿足市場需求[4]。

全世界范圍內(nèi)都在進(jìn)行羊肚菌研究,人們對(duì)羊肚菌的人工栽培作了不少探索。國內(nèi)有關(guān)羊肚菌室外栽培和室內(nèi)栽培的報(bào)道很多,四川綿陽食用菌研究所采用基因重組技術(shù)培育出新菌種,人工栽培羊肚菌成功,并獲國家專利[5]。但因?yàn)檠蚨蔷斯ぴ耘啻嬖谥纫斐稍纬傻臓I養(yǎng)生理先決條件,又要有效地誘導(dǎo)有性過程發(fā)生的雙重困難,所以目前尚不能商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[6]。

因?yàn)檠蚨蔷侥壳岸疾荒苓M(jìn)行大規(guī)模人工栽培,所以人們就更側(cè)重于羊肚菌菌絲的發(fā)酵研究,液體發(fā)酵可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn),具有規(guī)模大、菌絲體產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高等優(yōu)點(diǎn)[7]。多年來,科研工作者致力于建立菌絲體生物量的最佳發(fā)酵工藝條件的探索,不斷改進(jìn)羊肚菌菌絲的風(fēng)味、營養(yǎng)成分和有效成分,已取得了豐碩的成果[8]。

因此,為了加快我區(qū)羊肚菌資源的開發(fā)與利用,以我區(qū)野生羊肚菌為材料,在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行液體培養(yǎng),致力探究其在液體培養(yǎng)中的適宜環(huán)境條件,以期為實(shí)現(xiàn)羊肚菌半人工栽培、羊肚菌進(jìn)一步開發(fā)利用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為2011年5月于石河子南山采得野生黑脈羊肚菌子實(shí)體,通過組織分離獲得純化菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

①羊肚菌最佳培養(yǎng)方式與光照條件的篩選 此試驗(yàn)為二因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn),A因素為培養(yǎng)方式, A1為旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng),A2為水平搖床培養(yǎng),A3為靜置培養(yǎng)；B因素為光照條件,B1為透明錐形瓶,B2為棕色試劑瓶。即用葡萄糖30 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、硝酸鈉0.9 g、水1 000 mL配制液體培養(yǎng)基[9],分別分裝于透明錐形瓶和棕色試劑瓶內(nèi),常規(guī)方法滅菌,接入活化菌絲,分別放入旋轉(zhuǎn)式搖床、水平式搖床中和靜置條件下培養(yǎng),培養(yǎng)完全(14 d),拿出標(biāo)號(hào),過濾,烘干,稱質(zhì)量,記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行處理及分析。在數(shù)據(jù)處理時(shí),將A1、A2、A3與B1、B2所得數(shù)據(jù)分別匯總在相關(guān)處理中進(jìn)行分析。

②羊肚菌最適pH值的篩選[10]用葡萄糖30 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、硝酸鈉0.9 g、水1 000 mL配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,為了便于觀察分裝于透明錐形瓶內(nèi),并分別調(diào)pH值到4.5、5.5、6.5、7.5、8.5五個(gè)梯度,接種后放入旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后拿出過濾,烘干,稱質(zhì)量,記錄數(shù)據(jù)并分析。

③羊肚菌最佳培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的篩選[11]A為培養(yǎng)基1,馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、玉米粉5 g、水1 000 mL。B為培養(yǎng)基2,馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨0.5 g、水1 000 mL。C為培養(yǎng)基3,馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、玉米粉5 g、水1 000 mL。D為培養(yǎng)基4,黃豆芽 200 g、蔗糖20 g、玉米粉5 g、水1 000 mL。其余操作步驟同1.2②。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌最佳培養(yǎng)方式與光照條件的篩選

由表1可知,從羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)方式[12]的篩選試驗(yàn)可以明顯看出,旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng)方式的菌絲生物產(chǎn)量最大,水平搖瓶培養(yǎng)方式次之,而靜置培養(yǎng)時(shí)菌絲的生物產(chǎn)量最低。通過對(duì)此因素的方差比較可看出,旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng)與其他培養(yǎng)間存在顯著差異,而水平搖瓶培養(yǎng)與靜置培養(yǎng)間無顯著差異。通過標(biāo)準(zhǔn)偏差可看出,靜置培養(yǎng)的菌絲各水平生物產(chǎn)量偏離平均數(shù)的距離的平均數(shù)最小,即平均數(shù)的代表性最強(qiáng),而旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng)方式次之,水平搖瓶培養(yǎng)方式的產(chǎn)量平均數(shù)的代表性最弱,則更加充分地說明靜置培養(yǎng)方式為最不適合羊肚菌菌絲在液體環(huán)境中生長的培養(yǎng)方式。所以在有條件的情況下建議考慮采取旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng)。

在羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)的光照條件篩選試驗(yàn)中,通過平均數(shù)及方差的比較可以明顯看出,在接受正常光照的透明錐形瓶內(nèi)生長的菌絲生物產(chǎn)量低,而用棕色試劑瓶作為培養(yǎng)容器時(shí)菌絲的生物產(chǎn)量相對(duì)較高。通過對(duì)此因素的方差比較分析可看出,用透明錐形瓶作為培養(yǎng)容器與用棕色試劑瓶作為培養(yǎng)容器間差異不顯著。通過標(biāo)準(zhǔn)偏差可看出,用棕色試劑瓶培養(yǎng)的菌絲各水平生物產(chǎn)量平均數(shù)的代表性最強(qiáng),用透明錐形瓶培養(yǎng)的產(chǎn)量平均數(shù)的代表性相對(duì)較弱,則更加充分地說明用棕色試劑瓶培養(yǎng)的菌絲比用透明錐形瓶培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量高,即在液體培養(yǎng)羊肚菌菌絲時(shí)菌絲對(duì)光照很敏感,在陰暗潮濕的環(huán)境中生長的較好,而在正常光照條件下表現(xiàn)為抑制菌絲生長。

2.2 羊肚菌最適pH值的篩選

由表2可知,在羊肚菌菌絲液體酸堿度[13]的篩選試驗(yàn)中,通過平均數(shù)及方差的比較可以明顯看出,pH值7.5的培養(yǎng)液培養(yǎng)的菌絲生物產(chǎn)量最大, pH值6.5的培養(yǎng)液次之,而pH值4.5的培養(yǎng)液培養(yǎng)出的菌絲的生物產(chǎn)量最低。通過對(duì)此因素的方差比較可看出,各酸堿度不同的培養(yǎng)液水平間培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量均無顯著差異。通過標(biāo)準(zhǔn)偏差的比較可看出,pH值4.5的培養(yǎng)液培養(yǎng)的菌絲各水平生物產(chǎn)量平均數(shù)的代表性最強(qiáng),而pH值8.5的培養(yǎng)液次之, pH值7.5的培養(yǎng)液培養(yǎng)的產(chǎn)量平均數(shù)的代表性最弱,則更加充分地說明pH值4.5的培養(yǎng)液為最不適合羊肚菌菌絲生長的液體環(huán)境的酸堿程度。而在各酸堿度不同的培養(yǎng)液間的菌絲生物產(chǎn)量差異不顯著,所以在有條件的情況下建議將培養(yǎng)液的pH值控制在7.5左右。

2.3 羊肚菌最佳培養(yǎng)基及營養(yǎng)物質(zhì)的篩選

采用烘干法測得培養(yǎng)好的菌絲所得數(shù)據(jù)及處理見表3。

由表3可知,在羊肚菌培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)[14]的篩選試驗(yàn)中,通過平均數(shù)及方差的比較可以明顯看出,D培養(yǎng)的菌絲生物產(chǎn)量最大,C次之,而B培養(yǎng)出的菌絲的生物產(chǎn)量最低。通過方差分析可以看出,D與C、A和B間存在極顯著差異,B與C間差異顯著,C與A間差異不顯著,A與B間差異顯著。通過標(biāo)準(zhǔn)偏差比較可看出,A培養(yǎng)的菌絲各水平生物產(chǎn)量平均數(shù)的代表性最強(qiáng),而C次之,D培養(yǎng)的產(chǎn)量平均數(shù)的代表性最弱,則更加充分地說明B為最不適合羊肚菌菌絲生長的營養(yǎng)環(huán)境,D中的營養(yǎng)物質(zhì)為最適合羊肚菌菌絲生長的物質(zhì),所以在有條件的情況下建議在液體培養(yǎng)基中加入D所有的營養(yǎng)成分。

表1 不同培養(yǎng)方式所得羊肚菌菌絲干質(zhì)量

表2 不同pH值條件培養(yǎng)出的菌絲干質(zhì)量

表3 不同培養(yǎng)基間方差分析

A和B的不同營養(yǎng)成分是玉米粉和蛋白胨,C和D的不同營養(yǎng)成分是馬鈴薯和黃豆芽,A和C的不同營養(yǎng)成分是葡萄糖和蔗糖,將其分別進(jìn)行比較。

在A與B的比較中,含玉米粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量比含蛋白胨的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量高,所以可以確定玉米粉比蛋白胨更適合作新疆野生羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。在C與D的比較中,含黃豆芽的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量比含馬鈴薯的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量高,所以可以確定黃豆芽比馬鈴薯更適合作新疆野生羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。在A與C的比較中,含蔗糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量比含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量高,所以可以確定蔗糖比葡萄糖更適合作新疆野生羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。

綜上所述,最佳的理論培養(yǎng)基成分為黃豆芽200 g、玉米粉5 g、蔗糖20 g、水1 000 mL。

3 結(jié)論與討論

在羊肚菌最佳培養(yǎng)方式的篩選試驗(yàn)中,可選出最佳的菌絲培養(yǎng)方式為旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng),水平搖瓶培養(yǎng)次之,靜置培養(yǎng)則最不適宜其生長,并且對(duì)菌絲產(chǎn)量影響較大。在羊肚菌最佳光照條件的篩選試驗(yàn)中,可選出最適的菌絲生長的培養(yǎng)容器為棕色試劑瓶,而以透明錐形瓶作為培養(yǎng)容器時(shí)不適宜其生長,并且對(duì)菌絲產(chǎn)量有所影響。所以新疆野生羊肚菌比較適宜在稍弱光的條件下生長,強(qiáng)光抑制其生長發(fā)育。通過平均數(shù)比較明顯可見旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng)與接收自然光照組合培養(yǎng)的菌絲生物產(chǎn)量最高,為最優(yōu)組合；靜置培養(yǎng)與接收自然光照組合培養(yǎng)的菌絲生物產(chǎn)量最低,為最差組合。所以在生產(chǎn)上如有搖瓶培養(yǎng)箱則無需增加遮光措施,而無搖瓶培養(yǎng)箱時(shí)可適當(dāng)遮光以增加產(chǎn)量。

在羊肚菌菌絲培養(yǎng)液最適酸堿度的篩選試驗(yàn)中,可選出最適的菌絲培養(yǎng)液為pH值7.5,pH值6.5的培養(yǎng)液次之,而pH值4.5的培養(yǎng)液最不適宜其生長,并且對(duì)菌絲產(chǎn)量影響較大。所以新疆野生羊肚菌比較適合在微堿性環(huán)境下生長,菌絲液體培養(yǎng)的最適pH值為7.5。

在羊肚菌培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的篩選試驗(yàn)中,可選出最適的營養(yǎng)組分為培養(yǎng)基4中所有成分；培養(yǎng)基3次之；而培養(yǎng)基2為最不適宜其生長,并且對(duì)菌絲產(chǎn)量影響較大。培養(yǎng)基4的配方中的營養(yǎng)物質(zhì)組合能夠較好的滿足羊肚菌菌絲的生長,所得菌絲產(chǎn)量也最高。即黃豆芽200 g、玉米粉5 g、蔗糖20 g、水1 000 mL。

通過此次試驗(yàn),我們明確了黑脈羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)的基本條件,在棕色瓶內(nèi)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)式搖瓶培養(yǎng)是最佳培養(yǎng)方式,最適pH值為7.5,最適培養(yǎng)基為培養(yǎng)基4,即黃豆芽 200 g(煮汁)、蔗糖20 g、玉米粉 5 g、水1 000 mL。但是這些因素的組合效應(yīng)如何,還需進(jìn)一步探究比較。

本試驗(yàn)以我區(qū)野生黑脈羊肚菌為材料,在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行液體培養(yǎng),探明了其在液體培養(yǎng)中適宜環(huán)境條件,以便進(jìn)一步對(duì)其馴化栽培和開發(fā)利用做好基礎(chǔ)工作。有利于建立菌絲體生物量的最佳發(fā)酵工藝條件,實(shí)現(xiàn)自控分批生產(chǎn),改進(jìn)羊肚菌菌絲的風(fēng)味,提高其營養(yǎng)成分和醫(yī)療保健價(jià)值,還大大增加了菌絲培養(yǎng)的生物產(chǎn)量[15]。同時(shí),本試驗(yàn)的研究結(jié)果可為實(shí)現(xiàn)羊肚菌半人工栽培、羊肚菌進(jìn)一步開發(fā)利用等提供科學(xué)依據(jù),加快了我區(qū)羊肚菌資源的開發(fā)與利用。

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Study on Liquid Culture Conditions for Mycelium of Xinjiang Peck

Taking the strain of Xinjiang Peck as material,we primary studied its optimum liquid culture conditions,including suitable culture way,pH value,light condition,medium component and so on.The results showed that,the biological yield of mycelium was highest while the strain was cultured in rotary brown shake flask,and the most suitable pH value was 7.5.Medium 4,with 200 g soybean sprouts(boiled to juice),20 g sucrose,5 g corn flour and 1 000 mL sterilized water,was optimum for the mycelium growth of Xinjiang Peck.

Peck;Liquid culture;Mycelium

S646.9

:A

:1001-3547(2013)16-0071-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.16.023

吳新宇（1991-），女，在讀本科，主要從事食用菌生理方面的研究，E-mail：44063230@qq.com

鄭群（1968-），通信作者，男，博士，副教授，從事蔬菜生理生態(tài)研究，E-mail：zq1508@sina.com

2013-06-15