戴照義，吳金平，王運強，郭鳳領(lǐng)，韋向陽

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，武漢，430064）

早春保護地西瓜上市早，價格高，經(jīng)濟效益好，近年來在湖北發(fā)展較快，其對西甜瓜嫁接苗的巨大市場需求促進了工廠化育苗的快速發(fā)展。但由于部分小型育苗場設(shè)施簡陋，環(huán)境調(diào)控能力差，加上不注重種子處理，苗期頻發(fā)多種病害。2012年3～4月，湖北省低溫陰雨持續(xù)時間長，宜城市小型苗場發(fā)病較重。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所對其中發(fā)生較為普遍的2種病害進行了分離、鑒定，以期對其防治起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從湖北宜城市流水鎮(zhèn)育苗場西瓜苗上采集病樣，圖1-a病樣的病部有粉紅色霉?fàn)钗?，圖1-b病樣的病部呈水漬狀，用組織分離法[1]分離病原菌，然后純化、保存。

1.2 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則[2]進行寄主活體接種，接種菌絲，以清水為空白對照，3次重復(fù)。出現(xiàn)田間相同的癥狀時再次分離，并將2次獲得的分離菌作比較，以確定該菌病原菌。

圖1 西瓜苗期病害癥狀

1.3 DNA提取

將病原菌菌塊移至馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）平板上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)48～72 h，然后將菌落邊緣的菌絲切成2～3 mm的菌落小塊，把4～5塊菌絲移至PSA液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d。將液體培養(yǎng)好的病菌菌絲，在雙層尼龍網(wǎng)上過濾，用水洗滌2次，以除去菌絲內(nèi)的培養(yǎng)液，收集菌絲，將其包好放在硅膠中過夜，吸干水分，用液氮研磨成粉末，參照Knapp等[3]報道的CTAB（Cetyltrim-ethyl ammonium bromide）法提取病菌菌絲DNA。

①PCR引物 病原菌rDNA的ITS區(qū)域PCR擴增選用的引物分別為ITS-F和ITS-R，其堿基序列如下[4]：ITS-F（5'-GTCCTAACAAGGTTTCCGTA-3'），ITS-R（5'-TTCTCCGCT TATTGATATGC-3'）。

②PCR混合物 10 mmol/L三磷酸堿基脫氧核苷酸 0.6 μL，20 mmol/L 氯化鎂 1.2 μL， 緩沖液 2.0 μL，加 10 μmol/L 引物 ITS-F 和 ITS-R 各 1.0 μL，2 U/μL Taq 酶 1.0 μL，模板 1.0 μL，使用超純水將反應(yīng)體系補至 20 μL。

③PCR反應(yīng) 熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，循環(huán) 36次；72℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測到600 bp左右的條帶，將病原菌基因組PCR擴增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體進行pGEM-T連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選，選取陽性菌落擴大培養(yǎng)后，部分菌液用M13進行PCR擴增，凝膠電泳檢測，并將檢測后確認含有目的片段的陽性克隆送到華大基因測序公司測序，將測序結(jié)果提交GenBank進行分析。根據(jù)序列分析和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，對所分離的病原菌進行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌回接鑒定

菌絲接種第5天病部有粉紅色霉?fàn)钗铮▓D 2-a）和水漬狀（圖 2-b），與田間癥狀相同。從回接表現(xiàn)癥狀的病葉中再次分離到病原菌。

2.2 病原菌的rDNA-ITS序列驗證

用病原菌 rDNA的ITS區(qū)域進行擴增，均擴增出約600 bp的特異性片段 （圖3）。測序后通過GenBank軟件比對序列：病樣1-a分離獲得的菌株1～2的rDNA ITS序列與Fusarium oxysporum的相似度達99%，而西瓜枯萎病的致病菌是尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵.oxysporumSchl.f.sp.niveum（E.F.Smith）Snyber et Hansen），初步判斷所得病菌為西瓜枯萎病致病菌[5]。病樣1-b分離獲得的菌株3～4的rDNA ITS序列與半知菌交鏈孢霉屬（Alternaria sp.）的序列相似度高達99%，西瓜葉枯病的致病菌是瓜鏈格孢菌（A.cucumerin），初步判斷所得病菌為西瓜葉枯病致病菌[6]。

3 小結(jié)與討論

西瓜枯萎病和葉枯病均可全生育期發(fā)病，且以中后期發(fā)病為主，傳播途徑以土壤和病殘體帶菌為主，種子也可攜帶病菌。本研究中苗期大量發(fā)病與嫁接育苗過程中過度保濕、連續(xù)陰雨、光照不足、種子消毒不徹底等有關(guān)。

圖2 分離的兩個菌回接癥狀

本研究所收集的2個病樣，1-a病樣的病部有粉紅色霉?fàn)钗?，這與已經(jīng)報道的西瓜枯萎病癥狀相似；1-b病樣的病部初為水漬狀小點，后擴展成淺褐色至褐色、圓形或半圓形的水漬狀病斑，這與已報道的西瓜葉枯病癥狀相似[7]。但為了進一步確定病害病原菌，本研究利用位于rDNA上的高度保守序列作為通用引物對病原菌進行PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物通過連接、轉(zhuǎn)化并測序，所得序列通過GenBank上的Blast，確定其分類地位。該方法最大優(yōu)點是適用于所有真菌研究，最大缺點是必須通過測序才能確定病原菌分類地位。而根據(jù)特定生物ITS區(qū)域的DNA序列設(shè)計出來的特異引物，因為不同物種間ITS序列的變異性較大，所以只有與特異性引物相對應(yīng)的真菌才能擴增出相應(yīng)的ITS產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物電泳后，只需檢查有無擴增條帶即可得出明確的結(jié)果[8]。因此，下一步將設(shè)計特異引物辨別西瓜不同病害的致病種，使檢測速度更加快捷，時間更加縮短，最終使其指導(dǎo)實際生產(chǎn)。

圖3 西瓜苗期兩病害PCR擴增電泳圖

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